Name: Dissektion und Isolierung von regionenspezifisch dezellularisiertem Lungengewebe (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-29T14:50:00.000+00:00
Duration: 5 min 25 s
Description: Erfahren Sie die Isolation regionalen dezellularisierten Lungengewebes zur Analyse der extrazellulären Matrix. Diese Methode ermöglicht präzise Modellsysteme für Tissue-Engineering-Anwendungen und die Untersuchung regionaler Proteomsignaturen.

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Die Autoren danken den UVM-Autopsiediensten für die Beschaffung menschlicher Lungen und Robert Pouliot PhD für seine Beiträge zu den gesamten Dissektionstechniken. Diese Studien wurden durch R01 HL127144-01 (DJW) unterstützt.

Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit der IACUC der University of Vermont (UVM) durchgeführt. Alle menschlichen Lungen wurden von UVM Autopsy Services entnommen und die damit verbundenen Studien wurden gemäß den Richtlinien des IRB von UVM durchgeführt.
HINWEIS: Die Dezellularisierung der Lunge von Schweinen und Menschen wurde bereits von unserer Gruppe 7,8,9,10,21 beschrieben. Kurz gesagt, ganze Lungenlappen werden durch sequentielle Perfusion der Atemwege und Gefäße mit einer Reihe von 2-Liter-Detergenzien- und Enzymlösungen unter Verwendung einer Peristaltikpumpe dezellularisiert: 0,1 % Triton-X 100, 2 % Natriumdesoxycholat, 1 M Natriumchlorid, 30 μg/ml DNase/1,3 mM MgSO 4/2 mM CaCl2, 0,1 % Peressigsäure/4 % Ethanol, und eine Reinigung mit deionisiertem Wasser. Zu den Standardmethoden zur Bestätigung einer effizienten Dezellularisierung gehören die Bestimmung von <50 ng/mg doppelsträngiger DNA in dezellularisierten Lungen und die Abwesenheit von DNA-Fragmenten durch Gelelektrophorese sowie die Kernfärbung durch Hämatoxylin- und Eosin-Färbung (H&E) 9,21.
1. Einrichtung
<ol><li>Sammeln Sie alle notwendigen Geräte, die für das Präparieren erforderlich sind, einschließlich einer Glasauflaufform, zwei Paar chirurgischer Pinzetten, einer Pinzette und einer chirurgischen Schere, und eines Autoklaven, bevor Sie es verwenden.</li>
	<li>Entnehmen Sie einen Abschnitt der Lunge, legen Sie ihn in die Glasauflaufform und richten Sie ihn so aus, dass das obere Ende der Atemwege deutlich zu sehen ist.</li>
	<li>Identifizieren Sie das proximale Ende des Gefäßsystems und lassen Sie es bis zu späteren Schritten intakt. Das Ende des Gefäßsystems sollte deutlich sichtbar und vollständig undurchsichtig weiß sein.</li>
	<li>Entfernen Sie mit einer Pinzette und einer chirurgischen Schere alle Pleura, die möglicherweise die Außenseite der Lunge auskleidet, und entsorgen Sie sie.</li>
</ol>2. Freilegung der Atemwege
<ol><li>Arbeiten Sie mit einer Spreiztechnik mit der chirurgischen Schere vorsichtig vor, um die zusätzlichen Atemwege freizulegen.<ol><li>Suchen Sie den größten Atemweg, der in der Regel einen Durchmesser von ca. 2-4 cm hat. Eine weitere Möglichkeit, einen Atemweg zu identifizieren, ist die Betrachtung von Knorpelringen, die visuell oder durch Abtasten des Gewebes erkannt werden können.</li>
		<li>Tasten Sie mit einer Pinzette die Länge der Atemwege ab, um die Position des unsichtbaren Atemwegs bis zu einer Tiefe von etwa 1 Zoll zu bestimmen. HINWEIS: Da die Atemwege mit Knorpelringen ausgekleidet sind, sind sie charakteristisch härter als die anderen Lungengewebe. Daher sollte das Auffinden und Abtasten der unsichtbaren Atemwege relativ einfach sein.</li>
		<li>Halten Sie die chirurgische Schere parallel zu den Atemwegen und führen Sie die geschlossenen Spitzen in das Gewebe ein, das die unsichtbaren Atemwege direkt umgibt.</li>
		<li>Öffnen Sie langsam die chirurgische Schere, um die umgebende Membran vorsichtig auseinander zu ziehen. Entfernen Sie anschließend die chirurgische Schere und vermeiden Sie es, Gewebe zu schneiden.</li>
		<li>Wiederholen Sie diesen Vorgang während des gesamten Dissektionsverfahrens mit Unterbrechungen, um die Atemwege weiter freizulegen.</li>
	</ol></li>
	<li>Schneiden Sie mit der chirurgischen Schere die Atemwege an den Verzweigungspunkten ab und präparieren Sie entlang jeder Äste unabhängig voneinander. HINWEIS: Ein Verzweigungspunkt ist eine Stelle, an der sich ein Atemweg in zwei separate Atemwege aufteilt.</li>
	<li>Trennen Sie Regionen der Atemwege, sobald Sie sicher sind, dass die intakten Enden identifizierbar bleiben und für eine weitere Präparation leicht lokalisiert werden können.</li>
	<li>Legen Sie durchtrennte Bereiche der Atemwege in den entsprechenden Schlauch. Die Größe der abgetrennten Regionen variiert je nach Probe, liegt aber im Allgemeinen zwischen 1 und 5 cm Länge. Die Breite variiert je nach relativer Lage entlang des Atemwegsbaums, wobei die distalen Regionen eine geringere Breite aufweisen als die proximaleren Regionen.</li>
</ol>3. Freilegen und Herausschneiden von Gefäßregionen
<ol><li>Üben Sie sanften Druck auf die Gefäße aus und ziehen Sie sich langsam von den Atemwegen weg. Lassen Sie das Gefäßsystem leicht dehnen und verwenden Sie eine chirurgische Schere, um das Gefäßsystem weiter von den Atemwegen zu trennen. Anmerkungen: Zu viel Druck reißt das Gefäßsystem. Wenn das Gefäßsystem reißt, legen Sie einfach diesen Abschnitt des Gefäßsystems in den entsprechend beschrifteten Schlauch und identifizieren Sie sein intaktes Ende.</li>
	<li>Wenn eine Verzweigungsstelle im Gefäßbaum freigelegt wurde, verwenden Sie eine chirurgische Schere und Pinzette, um tiefere Regionen des Gefäßsystems freizulegen.<ol><li>Führen Sie zunächst die geschlossenen Spitzen der OP-Schere knapp unterhalb einer Verzweigungsstelle und zwischen den beiden entsprechenden Gefäßregionen ein.</li>
		<li>Öffnen Sie die Schere langsam, um das darunter liegende Gewebe auseinander zu spreizen.</li>
		<li>Verwenden Sie intermittierend eine Pinzette, um das Gewebe zu entfernen, das mit der chirurgischen Schere auseinandergespreizt wurde, sowie alle anderen Gewebe, die das Gefäßsystem direkt umgeben.</li>
	</ol></li>
	<li>Wenn das Gefäßsystem Regionen der Atemwege bedeckt oder für einen Schritt des Dissektionsverfahrens umständlich wird, durchtrennen Sie das Gefäßsystem an einem Verzweigungspunkt und präparieren Sie entlang eines der beiden Zweige unabhängig voneinander weiter.</li>
	<li>Trennen Sie Regionen des Gefäßsystems, sobald Sie sicher sind, dass die intakten Enden identifizierbar bleiben und für eine weitere Präparation leicht lokalisiert werden können.</li>
</ol>4. Identifizierung und Entfernung von Alveolargewebe
<ol><li>Kneifen Sie mit einer Pinzette oder Pinzette kleine Regionen des Alveolargewebes zusammen und reißen Sie sie dann vorsichtig ab.<ol><li>Lokalisieren Sie eine Geweberegion, die sich nicht in unmittelbarer Nähe der Atemwege oder der Gefäße befindet.</li>
		<li>Drücken Sie mit der Pinzette einen kleinen Bereich des Gewebes zusammen, der frei von Gefäßen oder Atemwegen zu sein scheint.</li>
		<li>Reißen Sie den eingeklemmten Bereich des Gewebes aus der Lunge.</li>
	</ol></li>
	<li>Beobachten Sie den Bereich des entnommenen Gewebes und bestätigen Sie, ob es sich um Alveolargewebe handelt oder nicht. HINWEIS: Alveolargewebe ist in der gesamten Lunge vorhanden und kann und sollte daher während des gesamten Dissektionsverfahrens entfernt werden. Jegliches Gewebe, das nicht leicht als primär Alveolen, Gefäße oder Atemwege identifiziert werden kann, sollte als Schüttgewebe kategorisiert und in das entsprechend gekennzeichnete Röhrchen gelegt werden.</li>
</ol>

Regionale Isolierung von dezellularisiertem Lungengewebe zur Untersuchung von Zell-Zell- und Zell-ECM-Interaktionen

<ol><li>López-Campos, J. L., Tan, W., Soriano, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+burden+of+COPD%5BTitle%5D)+AND+%22Respirology%22%5BJournal%5D)">Global burden of COPD.</a> Respirology. 21 (1), 14-23 (2016).</li>
<li>Raherison, C., Girodet, P. -O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+of+COPD%5BTitle%5D)+AND+%22European+Respiratory+Review%22%5BJournal%5D)">Epidemiology of COPD.</a> European Respiratory Review. 18 (114), 213-221 (2009).</li>
<li>Glass, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Idiopathic+pulmonary+fibrosis%3A+Current+and+future+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22The+Clinical+Respiratory+Journal%22%5BJournal%5D)">Idiopathic pulmonary fibrosis: Current and future treatment.</a> The Clinical Respiratory Journal. 16 (2), 84-96 (2022).</li>
<li>Dickinson, K. M., Collaco, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cystic+Fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatrics+in+Review%22%5BJournal%5D)">Cystic Fibrosis.</a> Pediatrics in Review. 42 (2), 55-67 (2021).</li>
<li>DeFreitas, M. R., McAdams, H. P., Azfar Ali, H., Iranmanesh, A. M., Chalian, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complications+of+lung+transplantation%3A+update+on+imaging+manifestations+and+management%5BTitle%5D)+AND+%22Radiology%3A+Cardiothoracic+Imaging%22%5BJournal%5D)">Complications of lung transplantation: update on imaging manifestations and management.</a> Radiology: Cardiothoracic Imaging. 3 (4), e190252(2021).</li>
<li>Young, K. A., Dilling, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+future+of+lung+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Chest%22%5BJournal%5D)">The future of lung transplantation.</a> Chest. 155 (3), 465-473 (2019).</li>
<li>Wagner, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+decellularization+and+recellularization+of+normal+versus+emphysematous+human+lungs%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Comparative decellularization and recellularization of normal versus emphysematous human lungs.</a> Biomaterials. 35 (10), 3281-3297 (2014).</li>
<li>Booth, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acellular+normal+and+fibrotic+human+lung+matrices+as+a+culture+system+for+in+vitro+investigation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Acellular normal and fibrotic human lung matrices as a culture system for in vitro investigation.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 186 (9), 866-876 (2012).</li>
<li>Uhl, F. E., Wagner, D. E., Weiss, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+decellularized+lung+matrices+for+cell+culture+and+protein+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Preparation of decellularized lung matrices for cell culture and protein analysis.</a> Methods in Molecular Biology. 1627, 253-283 (2017).</li>
<li>Wagner, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+scaffolds+of+acellular+human+and+porcine+lungs+for+high+throughput+studies+of+lung+disease+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional scaffolds of acellular human and porcine lungs for high throughput studies of lung disease and regeneration.</a> Biomaterials. 35 (9), 2664-2679 (2014).</li>
<li>Uhl, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+role+of+glycosaminoglycans+in+decellularized+lung+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Functional role of glycosaminoglycans in decellularized lung extracellular matrix.</a> Acta Biomaterialia. 102, 231-246 (2020).</li>
<li>Saldin, L. T., Cramer, M. C., Velankar, S. S., White, L. J., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+hydrogels+from+decellularized+tissues%3A+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix hydrogels from decellularized tissues: structure and function.</a> Acta Biomaterialia. 49, 1-15 (2017).</li>
<li>Giobbe, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+hydrogel+derived+from+decellularized+tissues+enables+endodermal+organoid+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix hydrogel derived from decellularized tissues enables endodermal organoid culture.</a> Nature Communications. 10 (1), 5658(2019).</li>
<li>Petrou, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clickable+decellularized+extracellular+matrix+as+a+new+tool+for+building+hybrid-hydrogels+to+model+chronic+fibrotic+diseases+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Materials+Chemistry.+B%22%5BJournal%5D)">Clickable decellularized extracellular matrix as a new tool for building hybrid-hydrogels to model chronic fibrotic diseases in vitro.</a> Journal of Materials Chemistry. B. 8 (31), 6814-6826 (2020).</li>
<li>Nizamoglu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+model+of+fibrosis+using+crosslinked+native+extracellular+matrix-derived+hydrogels+to+modulate+biomechanics+without+changing+composition%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">An in vitro model of fibrosis using crosslinked native extracellular matrix-derived hydrogels to modulate biomechanics without changing composition.</a> Acta Biomaterialia. 147, 50-62 (2022).</li>
<li>Marhuenda, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+extracellular+matrix+hydrogels+enhance+preservation+of+type+ii+phenotype+in+primary+alveolar+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Lung extracellular matrix hydrogels enhance preservation of type ii phenotype in primary alveolar epithelial cells.</a> International Journal of Molecular Sciences. 23 (9), 4888(2022).</li>
<li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+tissue+extracellular+matrix-derived+hydrogels+protect+against+radiation-induced+lung+injury+by+suppressing+epithelial-mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Lung tissue extracellular matrix-derived hydrogels protect against radiation-induced lung injury by suppressing epithelial-mesenchymal transition.</a> Journal of Cellular Physiology. 235 (3), 2377-2388 (2020).</li>
<li>Pouliot, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+characterization+of+a+naturally+derived+lung+extracellular+matrix+hydrogel%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Development and characterization of a naturally derived lung extracellular matrix hydrogel.</a> Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 104 (8), 1922-1935 (2016).</li>
<li>Pouliot, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porcine+lung-derived+extracellular+matrix+hydrogel+properties+are+dependent+on+pepsin+digestion+time%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering.+Part+C%2C+Methods%22%5BJournal%5D)">Porcine lung-derived extracellular matrix hydrogel properties are dependent on pepsin digestion time.</a> Tissue Engineering. Part C, Methods. 26 (6), 332-346 (2020).</li>
<li>de Hilster, R. H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+lung+extracellular+matrix+hydrogels+resemble+the+stiffness+and+viscoelasticity+of+native+lung+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Human lung extracellular matrix hydrogels resemble the stiffness and viscoelasticity of native lung tissue.</a> American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 318 (4), L698-L704 (2020).</li>
<li>Hoffman, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regional+and+disease+specific+human+lung+extracellular+matrix+composition%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Regional and disease specific human lung extracellular matrix composition.</a> Biomaterials. 293, 121960(2023).</li>
<li>Sicard, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+and+anatomical+variations+in+lung+tissue+stiffness%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Aging and anatomical variations in lung tissue stiffness.</a> American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 314 (6), L946-L955 (2018).</li>
</ol>

Keiner der Autoren hat Interessenkonflikte.

Dezellularisiertes Gewebe von Menschen und anderen Spezies wird häufig als Biomaterial für die Untersuchung der EZM-Zusammensetzung sowie der Zell-EZM-Interaktionen in Ex-vivo-Kulturmodellen, einschließlich 3D-Hydrogelen, verwendet12,13. Ähnlich wie andere Organe wurden dezellularisierte Lungen in der Vergangenheit verwendet, um Unterschiede in der EZM-Zusammensetzung in gesunden und kranken (d. h. emphysematösen und IPF) Lungen zu bestimmen, und werden ...

Lungenerkrankungen, einschließlich chronisch obstruktiver Lungenerkrankung (COPD), idiopathischer Lungenfibrose (IPF) und Mukoviszidose (CF), sind derzeit nicht heilbar 1,2,3,4. Die Lungentransplantation ist oft die einzige Option für Patienten in späteren Stadien, jedoch bleibt dies eine begrenzte Option, sowohl aufgrund der Bereitstellung geeigneter Spenderlungen als auch aufgrund der akuten und chronischen Abstoßung nach der Transplantation 3,5,6. Daher besteht ein dringender Bedarf an neuen Behandlungsstrategien. Ein vielversprechender Ansatz in der respiratorischen Biotechnik ist die Anwendung von Gewebegerüsten, die aus dezellularisiertem nativem Lungengewebe hergestellt werden. Da azelluläre Gerüste der gesamten Lunge einen Großteil der Komplexität der Zusammensetzung der nativen extrazellulären Matrix (EZM) und der Bioaktivität beibehalten, wurden sie intensiv für das Whole-Organ-Engineering und als verbesserte Modelle für die Untersuchung von Lungenkrankheitsmechanismen untersucht 7,8,9,10. Parallel dazu besteht ein zunehmendes Interesse an der Verwendung von dezellularisiertem Gewebe aus verschiedenen Organen, einschließlich der Lunge, als Hydrogele und andere Substrate für die Untersuchung von Zell-Zell- und Zell-ECM-Interaktionen in Organoid- und anderen Gewebekulturmodellen 11,12,13,14,15,16,17 . Diese liefern relevantere Modelle als kommerziell erhältliche Substrate wie Matrigel, die aus Tumorquellen gewonnen werden. Allerdings sind die Informationen über aus der menschlichen Lunge gewonnene Hydrogele derzeit relativ begrenzt. Wir haben bereits Hydrogele beschrieben, die aus dezellularisierten Schweinelungen gewonnen wurden, und sowohl ihre mechanischen als auch materiellen Eigenschaften charakterisiert sowie ihre Nützlichkeit als Zellkulturmodelle nachgewiesen18,19. In einem kürzlich veröffentlichten Bericht wurde die anfängliche mechanische und viskoelastische Charakterisierung von Hydrogelen beschrieben, die aus dezellularisierten, normalen und erkrankten (COPD, IPF) menschlichen Lungen gewonnen wurden20. Wir haben auch erste Daten zur Charakterisierung des Glykosaminoglykangehalts von dezellularisierten normalen und COPD-menschlichen Lungen sowie deren Anwendbarkeit für die Untersuchung von Zell-Zell- und Zell-EZM-Interaktionenvorgestellt 11.
Diese Beispiele veranschaulichen die Leistungsfähigkeit der Verwendung von dezellularisierten menschlichen Lungen-ECMs für Untersuchungszwecke. Die Lunge ist jedoch ein komplexes Organ, und sowohl die Struktur als auch die Funktion variieren in verschiedenen Regionen der Lunge, einschließlich der EZM-Zusammensetzung und anderer Eigenschaften wie Steifigkeit21,22. Daher ist es von Interesse, die EZM in einzelnen Regionen der Lunge zu untersuchen, einschließlich der Luftröhre und der großen Atemwege, der mittleren und kleinen Atemwege und der Lungenbläschen sowie der großen, mittleren und kleinen Blutgefäße. Zu diesem Zweck haben wir eine zuverlässige und reproduzierbare Methode entwickelt, um dezellularisierte Lungen von Menschen und Schweinen zu sezieren und anschließend jede dieser anatomischen Regionen zu isolieren. Dies ermöglichte eine detaillierte Differentialanalyse des regionalen Proteingehalts sowohl in der normalen als auch in der erkrankten Lunge21.

<table><tbody><tr><td>Bonn Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14184-09</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 - Feine Pinzette</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-02</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette, gebogen, F/S, stumpf, gezahnt - 130mm</td><td>CellPath</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Gehärtete Feinschere</td><td>Fine Science Tools</td><td>14090-11</td><td></td></tr><tr><td>Moria Iris Pinzette</td><td>Fine Science Tools</td><td>11373-22</td><td></td></tr><tr><td>Pyrex Glas-Auflaufform</td><td>Cole-Parmer</td><td>3175-10</td><td></td></tr></tbody></table>

dissektion und isolierung von regionenspezifisch dezellularisiertem lungengewebe

Dissection and Isolation of Region-Specific Decellularized Lung Tissue

Die Lungentransplantation ist oft die einzige Option für Patienten in den späteren Stadien einer schweren Lungenerkrankung, die jedoch sowohl durch die Versorgung mit geeigneten Spenderlungen als auch durch die akute und chronische Abstoßung nach der Transplantation begrenzt ist. Die Entwicklung neuer biotechnologischer Ansätze für den Ersatz erkrankter Lungen ist unerlässlich, um das Überleben der Patienten zu verbessern und Komplikationen im Zusammenhang mit den derzeitigen Transplantationsmethoden zu vermeiden. Ein alternativer Ansatz ist die Verwendung von dezellularisierten ganzen Lungen, denen zelluläre Bestandteile fehlen, die typischerweise die Ursache für akute und chronische Abstoßungsreaktionen sind. Da die Lunge ein so komplexes Organ ist, ist es von Interesse, die extrazellulären Matrixkomponenten bestimmter Regionen zu untersuchen, darunter das Gefäßsystem, die Atemwege und das Alveolargewebe. Ziel dieses Ansatzes ist es, einfache und reproduzierbare Methoden zu etablieren, mit denen Forscher regionsspezifisches Gewebe aus vollständig dezellularisierten Lungen sezieren und isolieren können. Das aktuelle Protokoll wurde für die Lunge von Schweinen und Menschen entwickelt, kann aber auch auf andere Tierarten angewendet werden. Für dieses Protokoll wurden vier Geweberegionen spezifiziert: Atemwege, Gefäße, Alveolen und Lungengewebe. Dieses Verfahren ermöglicht die Gewinnung von Gewebeproben, die den Inhalt des dezellularisierten Lungengewebes im Gegensatz zu herkömmlichen Bulk-Analysemethoden genauer darstellen.

Ein allgemeines Schema des Protokolls ist in Abbildung 1 dargestellt. Einmal gemeistert, ist die regionale Dissektion von dezellularisiertem Lungengewebe leicht reproduzierbar. Die Bestimmung der Kategorisierung jeder abgetrennten Gewebeprobe ist für den Erfolg des Dissektionsverfahrens unerlässlich. Gefäßgewebe ist wesentlich elastischer als die Atemwege, daher ist die Verwendung einer Pinzette zur Dehnung des Gewebes oft ein starker Indikator dafür, ob es sich bei einer bestimmten Probe um...

Hier wird ein Protokoll zur Isolierung von regional dezellularisiertem Lungengewebe vorgestellt. Dieses Protokoll bietet ein leistungsfähiges Werkzeug zur Untersuchung von Komplexitäten in der extrazellulären Matrix und Zell-Matrix-Interaktionen.

Dissektion und Isolierung von regionenspezifisch dezellularisiertem Lungengewebe

Lung transplantation is often the only option for patients in the later stages of severe lung disease, but this is limited both due to the supply of ...

Dezellularisierte Organe werden kontinuierlich in einer Vielzahl von Tissue-Engineering-Anwendungen eingesetzt. Die meisten dieser Studien betrachten jedoch das Organ als Ganzes und nicht die einzelnen anatomischen Regionen. Wir haben diese Methode entwickelt, um einzelne anatomische Regionen dezellularisierter menschlicher Lungen zu untersuchen, um präzisere Modellsysteme für nachgelagerte Anwendungen zu erhalten.Bei der Entwicklung von Modellsystemen ist es wichtig, verschiedene Designaspekte zu berücksichtigen, damit Ihr System die normale Biologie optimal rekapituliert. Für die Lunge sind dies Faktoren wie Umweltbelastung, zyklische mechanische Belastung und Elastizität, die sich zwischen unabhängigen Regionen der Lunge unterscheiden können. Mit dieser Methode konnten wir zeigen, dass die extrazelluläre Matrix, die aus einzelnen anatomischen Lungenregionen sowohl aus gesunden als auch aus erkrankten Lungen stammt, unterschiedliche proteomische Signaturen aufweist.Dies ermöglicht es uns, Lungenerkrankungen besser zu verstehen und möglicherweise neue therapeutische Wege zu finden. Um diese Forschung fortzusetzen, entwickelt unser Labor derzeit dreidimensionale Hydrogele aus gesun

dissection-and-isolation-of-region-specific-decellularized-lung-tissue

Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Wir haben eine dezellularisierte Lunge extrazellulären Matrix und neuartige biomimetische Bioreaktor verwendet werden, um funktionelle Lungengewebe erzeugen können entwickelt werden. Durch Aussaat Zellen in die Matrix und die Kultivierung im Bioreaktor, generieren wir Gewebe, das effektive Gasaustausch zeigt, wenn in vivo für kurze Zeit transplantiert.

Vorgehensweise für Lung Technik

Ein hoch gereinigte Präparation von Mauslunge dendritischen Zellen beschrieben wird. Besonderer Nachdruck wird auf die Isolierung von konventionellen dendritischen Zellen Teilmenge gegeben.

Isolierung von Maus Lung Dendritischen Zellen

Dieses Video demonstriert ein Verfahren zur Herstellung von dezellularisierten extrazellulären Matrix- oder EZM-Gerüsten durch Anwendung einer antegraden Perfusion von Detergenzien durch das Gefäßsystem. Die strukturellen ECM-Gerüste können dann verwendet werden, um den ECM-Umbau im Zusammenhang mit kardiopulmonalen Erkrankungen zu analysieren.

Dezellularisierung des kardiopulmonalen Komplexes: Eine Technik zur Dezellularisierung von Herz und Lunge aus dem Mausmodell

Die Dezellularisierung ganzer Organe erzeugt natürliche biologische Gerüste, die für die regenerative Medizin verwendet werden können. Die Beschreibung eines nichtmenschlichen Primatenmodells der Lungenregeneration wird vorgestellt, in dem ganze Lungen dezellularisiert und dann mit adulten Stammzellen und Endothelzellen in einem Bioreaktor besiedelt werden, der die Gefäßzirkulation und die Beatmung von Flüssigmedien erleichtert.

Dezellularisierung und Rezellularisierung der Lunge nichtmenschlicher Primaten mit einem spezialisierten Großorgan-Bioreaktor

Dieses Protokoll leitet effizient embryonalen Maus-Stammzellen abgeleiteten endgültigen Endoderm Epithelzellen der Atemwege zu reifen. Diese Differenzierung Technik verwendet 3-dimensional dezellularisierte Lungengerüste Lungen lineage Spezifikation, in einem definierten, serumfreien Kultureinstellung zu lenken.

Die Erzeugung von ESC-derived Maus Airway epithelialen Zellen unter Verwendung von Dezellularisierte Lung Scaffolds

Dies ist eine Methode, um eine 3-dimensionale Zellkultur Gerüst von pulmonaler extrazellulären Matrix zu schaffen. Intact Lunge in Hydrogelen verarbeitet, die das Wachstum von Zellen in drei Dimensionen zu unterstützen.

Tunable Hydrogele aus Pulmonary Extrazellulärmatrix für 3D-Zellkultur

Dieses Protokoll zielt darauf ab, das Herz und die Lunge von Mäusen zu dezellularisieren. Die resultierenden Gerüste der extrazellulären Matrix (ECM) können immungefärbt und abgebildet werden, um die Position und Topologie ihrer Komponenten abzubilden.

Dezellularisation des murinen Kardiopulmonalkomplexes

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Erzeugung reproduzierbarer, kleinräumiger künstlicher Lungengewebe, indem dezellularisierte, präzisionsgeschnittene Lungenschnitte mit alveolären Epithel-Typ-2-Zellen, Fibroblasten und Endothelzellen neu besiedelt werden.

Technisches Lungengewebe aus dezellularisierten Lungenscheiben

Das Protokoll erläutert zwei verschiedene Dezellularisierungsmethoden, die auf natives Lungengewebe von Rindern angewendet werden, und bietet eine umfassende Darstellung ihrer jeweiligen Charakterisierungen.

Entwicklung und Charakterisierung von dezellularisierten extrazellulären Lungenmatrix-Hydrogelen

In diesem Artikel wird beschrieben, wie biotechnologisch hergestellte Mauslungen mit Hilfe von Dezellularisierungs- und Rezellularisierungsmethoden hergestellt werden können. Es wird auch die anschließende orthotope Lungentransplantation beschrieben.

Transplantation einer biotechnologisch hergestellten Lunge unter Verwendung von dezellularisierten Mauslungen und primären humanen Endothelzellen

Das im Folgenden beschriebene Protokoll ist eine einfache und effektive Methode zur Isolierung von Retinoid-haltigen Zellen aus hochgradig heterogenen Lungenzellpopulationen unter Verwendung spezifischer Retinoid-Autofluoreszenz und unter Anwendung einer fluoreszenzaktivierten Zellsortierung.

Isolierung von Lungen-Retinoid-haltigen Zellen durch Zellsortierung

Erfahren Sie die Isolation regionalen dezellularisierten Lungengewebes zur Analyse der extrazellulären Matrix. Diese Methode ermöglicht präzise Modellsysteme für Tissue-Engineering-Anwendungen und die Untersuchung regionaler Proteomsignaturen.

Dissektion und Isolierung von regionenspezifisch dezellularisiertem Lungengewebe

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