Zellteilung

1. Beobachtung des Zellzyklus in einer Wurzelspitze Expand class="lab-items">
   Hypothesen: Die experimentelle Hypothese ist, dass in Wurzelspitzenscheiben, die mit Nocodazol behandelt wurden, einer Chemikalie, die die mikrotubuläre Polymerisation stört, alle Zellen im gleichen Stadium des Zellzyklus arretiert werden und dass in unbehandelten Zwiebelspitzenscheiben alle verschiedenen Stadien des Zellzyklus sichtbar gemacht werden. Die Nullhypothese ist, dass es keine Unterschiede in der Mitose zwischen den beiden Gruppen gibt und dass verschiedene Stadien des Zellzyklus sichtbar gemacht werden.
   Zur Vorbereitung auf dieses Experiment verwenden Sie eine Zwiebel, die mehrere Tage lang in Wasser gelegt wurde, bis neue weiße Wurzelspitzen zu sprießen beginnen. Schneide mit einer Rasierklinge ein 1 cm langes Stück vom Ende einer der Wurzelspitzen ab.
   Legen Sie die Zwiebelscheibe in ein Mikrozentrifugenröhrchen mit der Bezeichnung "N" für die Nocodazol-Bedingung.
   Schneiden Sie dann ein zweites 1 cm langes Stück Zwiebelwurzelspitze ab und legen Sie es in ein Mikrozentrifugenröhrchen mit der Bezeichnung "C" für die Kontrollbedingung.
   Fügen Sie 2 μl des 5 mg/ml-Nocodazols zu 1 ml Wasser im Mikrozentrifugenröhrchen mit der Bezeichnung N und 1 ml Wasser nur zu dem mit C gekennzeichneten Röhrchen hinzu.
   Lassen Sie die Röhrchen mit den Wurzelspitzen 12 Stunden lang inkubieren und wischen Sie den Arbeitsbereich mit 70% Ethanol ab.
   Wenn die Inkubation abgeschlossen ist, stellen Sie einen Heizblock auf 60 ºC ein.
   Waschen Sie die mit Nocodazol behandelten Spitzen mit Wasser und saugen Sie dann die Flüssigkeit an.
   Wiederholen Sie diesen Waschvorgang noch zwei Mal, für insgesamt drei Waschgänge.
   Füllen Sie beide Röhrchen mit 1 mL einer normalen Salzsäure. Inkubieren Sie die Röhrchen 12 - 15 Minuten lang in einem 60 ºC heißen Heizblock und entsorgen Sie dann die Säure in einen Abfallkolben.
   Geben Sie nun mindestens dreimal 1 ml destilliertes Wasser tropfenweise in die Röhrchen, um die Proben zu spülen.
   Fügen Sie nun einen Mikroliter DAPI-Färbung zu 10 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) hinzu.
   Geben Sie dann 50 μl dieses verdünnten DAPI-Farbstoffs in jedes Röhrchen und lassen Sie sie 12 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren.
   Führen Sie danach drei Waschgänge mit destilliertem Wasser durch, wie in Schritt 10.
   Beschriften Sie einen Objektträger als 'Kontrolle' und einen anderen als 'Nocodazol'.
   Übertragen Sie die gefärbten Wurzeln auf ihre jeweiligen Objektträger und fügen Sie einen Tropfen Wasser auf den Kontrollobjektträger und einen Tropfen Nocodazol auf den Nocodazol-Objektträger hinzu.
   Verwenden Sie die Rasierklinge, um die nicht gefärbten Teile jeder Wurzelspitze zu entfernen, und legen Sie einen Glasdeckzettel über jede Probe.
   Drücken Sie vorsichtig mit einer behandschuhten Fingerspitze auf jeden Deckblattträger und lassen Sie die Objektträger dann 10 Minuten lang ruhen.
   Betrachten Sie schließlich die Objektträger unter dem 40-fachen Objektiv eines Fluoreszenzmikroskops und nehmen Sie Bilder Ihrer Zellpräparate an der Wurzelspitze auf.
2. Den Verlust der Zellzykluskontrolle verstehen Expand class="lab-items">
   HINWEIS: Bevor Zellen alle Phasen des Zellzyklus durchlaufen können, müssen sie mehrere Prüfpunkte durchlaufen. Diese Checkpoints werden durch Cyclin und Cyclin-abhängige Kinaseproteine (CDKs) reguliert. Wenn die Cycline und CDKs feststellen, dass frühere zelluläre Ereignisse nicht ausreichend abgeschlossen wurden, werden sie die Zellen in diesem Schritt stoppen und verhindern, dass sie sich vermehren. In Krebszellen gehen eine oder mehrere dieser molekularen Fesseln zur Regulierung der Zellteilung verloren, und dies ermöglicht es den geschädigten Zellen, der Kontrolle der Zellproliferation zu entkommen. Diese abnormalen Zellen entwickeln sich zu Tumoren, bei denen es sich um Massen von unkontrollierten proliferierenden Zellen handelt, die die normalen Funktionen des Körpers beeinträchtigen. Beachten Sie, wie diese Krebszelle, bevor sie sich teilt, das Licht unter dem Lichtmikroskop sehr stark zusammenfasst und bricht. Das liegt daran, dass sich nicht alle Krebszellen nach jeder Mitoserunde erfolgreich in Tochterzellen teilen. Dies bedeutet, dass sie oft einen Überschuss an Organellen und DNA enthalten, und diese Zunahme des zellulären Gehalts bedeutet, dass sie das Licht stärker brechen als normale Zellen.
3. Ergebnisse Expand<ul class="lab-items">
4. Untersuchen Sie Ihre gesammelten Bilder und notieren Sie in Tabelle 1 die verschiedenen Zellstrukturen und Stadien, die in der mit Nocodazol behandelten Zwiebelspitzenscheibe identifiziert werden konnten. Klicken Sie hier, um Tabelle 1 herunterzuladen
5. Wenn es Zellen gibt, die sich einer Mitose unterziehen, notieren Sie, welche Stadien der Zellteilung Sie sehen.
6. Notieren Sie den Prozentsatz der Zellen in jedem Stadium der Mitose in Tabelle 1.
7. Untersuchen Sie als Nächstes die Bilder der unbehandelten Zwiebelspitzenscheibe und notieren Sie, welche Zellstrukturen Sie identifizieren können.
8. Wenn es Zellen gibt, die sich einer Mitose unterziehen, überlegen Sie, welche Stadien der Zellteilung Sie sehen, und notieren Sie die Prozentsätze der Zellen in jedem Stadium der Mitose in Tabelle 1.

Die experimentelle Hypothese ist, dass in Wurzelspitzenscheiben, die mit Nocodazol behandelt wurden, einer Chemikalie, die die mikrotubuläre Polymerisation stört, alle Zellen im gleichen Stadium des Zellzyklus arretiert werden und dass in unbehandelten Zwiebelspitzenscheiben alle verschiedenen Stadien des Zellzyklus sichtbar gemacht werden. Die Nullhypothese ist, dass es keine Unterschiede in der Mitose zwischen den beiden Gruppen gibt und dass verschiedene Stadien des Zellzyklus sichtbar gemacht werden. Zur Vorbereitung auf dieses Experiment verwenden Sie eine Zwiebel, die mehrere Tage lang in Wasser gelegt wurde, bis neue weiße Wurzelspitzen zu sprießen beginnen.

Schneide mit einer Rasierklinge ein einen Zentimeter großes Stück vom Ende einer der Wurzelspitzen ab. Legen Sie die Zwiebelscheibe in ein Mikrozentrifugenröhrchen mit der Bezeichnung N für den Nocodazol-Zustand. Schneiden Sie dann ein zweites ein Zentimeter großes Stück Zwiebelwurzelspitze ab und legen Sie es in ein Mikrozentrifugenröhrchen mit der Aufschrift C für die Kontrollbedingung.

Geben Sie zwei Mikroliter Nocodazol von fünf Milligramm pro Milliliter zu einem Milliliter Wasser in das Mikrozentrifugenröhrchen mit der Bezeichnung N und einen Milliliter Wasser in das mit C gekennzeichnete Röhrchen Röhrchen mit der Bezeichnung C. Lassen Sie die Röhrchen mit den Wurzelspitzen 12 Stunden lang inkubieren und wischen Sie den Arbeitsbereich mit 70 % Ethanol ab. Wenn die Inkubation abgeschlossen ist, stellen Sie einen Heizblock auf 60 Grad Celsius ein. Waschen Sie die mit Nocodazol behandelten Spitzen mit Wasser und saugen Sie dann die Flüssigkeit ab.

Wiederholen Sie diese Wäsche zweimal, um insgesamt drei Wäschen zu erhalten. Füllen Sie beide Röhrchen mit einem Milliliter einer normalen Salzsäure. Inkubieren Sie die Röhrchen 12 bis 15 Minuten lang in einem 60 Grad Celsius heißen Block, entsorgen Sie dann die Säure in einen Abfallkolben und geben Sie mindestens dreimal einen Milliliter destilliertes Wasser tropfenweise in die Röhrchen, um die Proben zu spülen.

Geben Sie nun einen Mikroliter DAPI-Farbstoff zu 10 Millilitern phosphatgepufferter Kochsalzlösung. Geben Sie dann 50 Mikroliter des verdünnten DAPI-Farbstoffs in jedes Röhrchen und lassen Sie sie bei Raumtemperatur 12 Minuten lang inkubieren. Nach dieser Vorform werden drei Waschgänge mit destilliertem Wasser durchgeführt, wie gerade gezeigt.

Beschriften Sie einen Objektträger als Control und einen anderen als Nocodazol. Übertragen Sie die gefärbten Wurzeln auf die entsprechenden Objektträger und geben Sie einen Tropfen Wasser auf den Kontrollobjektträger und einen Tropfen Nocodazol auf den Nocodazol-Objektträger. Verwenden Sie die Rasierklinge, um die fleckigen Teile jeder Wurzelspitze zu entfernen, und legen Sie einen Glasabdeckzettel über jede Probe.

Drücken Sie jeden Deckglas vorsichtig mit einer behandschuhten Fingerspitze nach unten und lassen Sie die Dias dann 10 Minuten einwirken. Betrachten Sie schließlich die Objektträger unter dem 40-fachen Objektiv eines Licht- oder Fluoreszenzmikroskops und nehmen Sie Bilder Ihrer Zellpräparate an der Wurzelspitze auf. Bevor Zellen alle Stadien des Zellzyklus durchlaufen können, gibt es mehrere Kontrollpunkte, die sie durchlaufen müssen.

Diese Checkpoints werden durch Cyclin und Cyclin-abhängige Kinaseproteine (CDKs) reguliert. Wenn die Cycline und CDKs feststellen, dass frühere zelluläre Ereignisse nicht ausreichend abgeschlossen wurden, werden sie die Zellen in diesem Schritt stoppen und verhindern, dass sie sich vermehren. In Krebszellen gehen eine oder mehrere dieser molekularen Fesseln zur Regulierung der Zellteilung verloren, und dies ermöglicht es den geschädigten Zellen, der Kontrolle der Zellproliferation zu entkommen.

Diese abnormalen Zellen entwickeln sich zu Tumoren, bei denen es sich um Massen von unkontrollierten proliferierenden Zellen handelt, die die normalen Funktionen des Körpers beeinträchtigen. Beachten Sie, wie diese Krebszelle, bevor sie sich teilt, das Licht unter dem Lichtmikroskop sehr stark zusammenfasst und bricht. Das liegt daran, dass sich nicht alle Krebszellen nach jeder Mitoserunde erfolgreich in Tochterzellen teilen.

Dies bedeutet, dass sie oft einen Überschuss an Organellen und DNA enthalten, und diese Zunahme des zellulären Gehalts bedeutet, dass sie das Licht stärker brechen als normale Zellen. Nachdem nun alle Daten gesammelt wurden, schauen wir uns unsere Ergebnisse an. Welche Zellstrukturen sind in der mit Nocodazol behandelten Zwiebelspitzenscheibe zu erkennen?

Gibt es Zellen, die sich einer Mitose unterziehen? Welche Stadien der Zellteilung sehen Sie? Notieren Sie den prozentualen Anteil der Zellen in jedem Stadium der Mitose in der Tabelle.

Schauen Sie sich als nächstes die unbehandelte Zwiebelspitzenscheibe an. Welche Zellstrukturen können Sie identifizieren? Gibt es Zellen, die sich einer Mitose unterziehen?

Welche Stadien der Zellteilung sehen Sie? Notieren Sie die Prozentsätze der Zellen in jedem Stadium der Mitose in der Tabelle. Sie werden bemerkt haben, dass sich die meisten Zellen in der mit Nocodazol behandelten Zwiebelscheibe aufgrund der Mikrotubuli-störenden Eigenschaften des Reagenzes, die die Bildung der Spindelfasern und die anschließende Chromosomentrennung und Zellteilung verhindern, im selben Mitosestadium befinden.

In den Zellen der unbehandelten Scheibe sind jedoch viele verschiedene Stadien der Mitose sichtbar, da die Mitose in gesunden Organismen ein fortlaufender Prozess ist.