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Quelle: Smaa Koraym von der Johns Hopkins University, MD, USA
Im ersten Teil dieses Experiments bereiten Sie eine Natriumphosphatlösung her, die bei einem pH-Wert von 7,0 gepuffert ist. Mononatriumphosphat ist eine schwache Säure mit der konjugierten Base Dinatriumphosphat. Uneingestellte Mononatriumphosphatlösungen haben in der Regel einen pH-Wert von etwa 4 - 6.
Puffer sind am effektivsten in der Nähe ihres pKa, der für Mononatriumphosphat bei 6,8 bis 7,2 liegt. Sie werden also NaOH verwenden, um das Gleichgewicht in Richtung der konjugierten Basis zu verschieben, ohne die Gesamtzusammensetzung des Puffergleichgewichts zu verändern.
| Molmasse von NaH2PO4 = 119,98 g/mol | |
| Volumen der Lösung (ml) | 200 |
| Molarität (mM) | 50 |
| Mol von NaH2PO4 (mol) | |
| Benötigte Masse (mg) | |
| Anfangsvolumen von 1 M NaOH (mL) | |
| Endvolumen von 1 M NaOH (mL) | |
| Volumen des verwendeten NaOH (ml) | |
| Volumen des benötigten DI-Wassers (ml) | |
Puffer können verwendet werden, um Verbindungen bei bestimmten pH-Werten zu bewerten. In diesem Abschnitt erfassen Sie das Absorptionsspektrum des Indikators Neutralrot in verschiedenen Puffern. Die protonierte Form von Neutralrot ist Rot und die deprotonierte Form ist gelb-orange, was bedeutet, dass sie grünes bzw. blau-violettes Licht absorbieren. Die saure und die basische Form weisen also unterschiedliche Absorptionswellenlängen auf. Die Proteinbindung verändert die Eigenschaften von Neutralrot und verändert sowohl seine Absorption als auch sein pKa.
Nachdem Sie das Absorptionsspektrum von freiem Neutralrot bei mehreren pH-Werten gemessen haben, fügen Sie den Lösungen Riboflavin-bindendes Protein (RP) hinzu und messen die Absorptionen erneut. Die Absorptionsintensität hängt mit der Konzentration zusammen, daher verwenden Sie die Spektren, um den pKa von freiem und gebundenem Neutralrot nach dem Labor zu bestimmen.
| Küvette # | Puffer pH | Abs. beiλ max (Freies NRH+) | Abs. beiλ max (Bound NRH) |
| 1 | 5.0 | ||
| 2 | 5.5 | ||
| 3 | 6.0 | ||
| 4 | 6.5 | ||
| 5 | 7.0 | ||
| 6 | 7.5 | ||
| 7 | 8.0 | ||
| 8 | 8.5 | ||
| 9 | 11 | ||
| 10 | leer |
Lassen Sie uns nun unsere Absorptionsdaten analysieren, um die pKa's von Neutralrot zu bestimmen.
| Kostenlos NRH+ | Gebunden NRH+ | |
| λmax (nm) | ||
| ΔA (nm) | ||
| Mittelpunkt (nm) | ||
| pKa |
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Im ersten Teil dieses Experiments bereiten Sie eine Natriumphosphatlösung her, die bei einem pH-Wert von 7,0 gepuffert ist. Mononatriumphosphat ist eine schwache Säure mit der konjugierten Base Dinatriumphosphat. Uneingestellte Mononatriumphosphatlösungen haben in der Regel einen pH-Wert von etwa 4 bis 6.
Puffer sind am effektivsten in der Nähe ihres pKa, der für Mononatriumphosphat bei 6,8 bis 7,2 liegt. Sie werden also Natriumhydroxid verwenden, um das Gleichgewicht in Richtung der konjugierten Base zu verschieben, ohne die Gesamtzusammensetzung des Puffergleichgewichts zu verändern. Bevor Sie mit dem Labor beginnen, berechnen Sie die Masse an Mononatriumphosphat, die Sie benötigen, um 200 Milliliter einer 50-Millimolaren Lösung herzustellen.
In diesem Bereich des Labors wird Natriumhydroxid verwendet, das ätzend und giftig ist. Seien Sie vorsichtig beim Einfüllen und Transportieren von Natriumhydroxid. Fangen wir nun an.
Ziehen Sie zunächst einen Laborkittel, eine spritzwassergeschützte Schutzbrille und Nitrilhandschuhe an. Füllen Sie anschließend eine 250-Milliliter-Plastikwaschflasche mit entionisiertem Wasser. Etikettieren Sie zwei 100-Milliliter-Becher für neutrale bzw. basische wässrige Abfälle.
Kalibrieren Sie dann Ihr pH-Messgerät mit den mitgelieferten Puffern. Bewahren Sie die Sonde in ihrer Aufbewahrungslösung auf, wenn Sie fertig sind. Bringen Sie nun ein 400-Milliliter-Becherglas in den Bereich der Analysenwaage, um das Mononatriumphosphat zu erhalten, das Sie benötigen.
Tarieren Sie ein Blatt Wägepapier und messen Sie mit einem sauberen Spatel die benötigte Menge an Mononatriumphosphat nach Ihren Berechnungen ab. Mononatriumphosphat absorbiert Feuchtigkeit aus der Luft, also arbeiten Sie schnell, um eine genaue Messung zu erhalten, und verschließen Sie den Behälter fest, wenn Sie damit fertig sind. Notieren Sie die genaue Menge an Mononatriumphosphat, die Sie in Ihrem Labornotizbuch messen.
Geben Sie dann das Mononatriumphosphat in das Becherglas und reinigen Sie den Spatel mit einem Labortuch. Werfen Sie das Wägepapier und das Labortuch weg, bevor Sie zu Ihrem Abzug zurückkehren. Verwenden Sie nun einen Messzylinder, um 175 Milliliter entionisiertes Wasser abzumessen.
Gießen Sie das Wasser in das Becherglas mit Mononatriumphosphat und fügen Sie einen magnetischen Rührstab hinzu. Rühren Sie die Lösung auf einer Rührplatte, bis sich das Salz vollständig aufgelöst hat und die Lösung homogen erscheint. Dies dauert in der Regel zwei bis drei Minuten.
Messen Sie dann 15 Milliliter entionisiertes Wasser mit einem Messzylinder. Gießen Sie das entionisierte Wasser in das Becherglas und rühren Sie die Lösung weiter, bis sie wieder homogen erscheint, was in der Regel ein bis zwei Minuten dauert. Schalten Sie dann den Rührmotor aus.
Spülen Sie die pH-Sonde mit entionisiertem Wasser und klemmen Sie sie dann mit dem Sensor über dem Rührstab in die Lösung. Bringen Sie nun einen 10-Milliliter-Messzylinder und ein Uhrglas zur Abgabehaube und messen Sie 10 Milliliter 1 molares Natriumhydroxid ab. Decken Sie Ihr Natriumhydroxid mit dem Uhrenglas ab und führen Sie es vorsichtig zu Ihrem Abzug.
Notieren Sie sich das genaue Volumen im Messzylinder. Rühren Sie dann die Mononatriumphosphatlösung weiter. Während Sie den pH-Wert überwachen, verwenden Sie eine Einwegpipette, um der Rührlösung langsam tropfenweise Natriumhydroxid hinzuzufügen.
Sobald der pH-Wert des Puffers 7,0 erreicht, führen Sie das noch in der Pipette befindliche Natriumhydroxid in den Messzylinder zurück. Berechnen Sie dann das Volumen an Natriumhydroxid, das Sie aus dem Anfangs- und Endvolumen im Messzylinder hinzugefügt haben. Subtrahieren Sie dieses Volumen von 10 Millilitern, um zu bestimmen, wie viel entionisiertes Wasser Sie Ihrem Puffer hinzufügen müssen, um ein Gesamtlösungsvolumen von 200 Millilitern zu erreichen.
Messen Sie das deionisierte Wasser, das Sie benötigen, mit einem weiteren 10-Milliliter-Messzylinder ab und geben Sie es zur Rührlösung, um die Herstellung des Puffers abzuschließen. Spülen Sie den pH-Sensor mit entionisiertem Wasser ab, decken Sie ihn mit der mit der Vorratslösung gefüllten Kappe ab und ziehen Sie den Netzstecker oder schalten Sie die Sonde aus. Beschriften Sie danach eine 250-Milliliter-Polyethylenflasche mit 50 Millimolar Mononatriumphosphatpuffer, pH 7,0. Verwenden Sie eine Pinzette, um den magnetischen Rührstab aus der Lösung zu holen.
Setze dann einen Trichter in die Öffnung der Flasche und gieße die Pufferlösung in die Flasche. Entferne den Trichter und verschließe die Flasche fest. Sie sind nun bereit, mit dem Bereich Absorptionsspektroskopie fortzufahren.
Puffer können verwendet werden, um Verbindungen bei bestimmten pH-Werten zu bewerten. In diesem Abschnitt erfassen Sie das Absorptionsspektrum des Indikators Neutralrot in verschiedenen Puffern. Die protonierte Form von Neutralrot ist Rot und die deprotonierte Form ist gelb-orange, was bedeutet, dass sie grünes bzw. blau-violettes Licht absorbieren.
Die saure und die basische Form weisen also unterschiedliche Absorptionswellenlängen auf. Die Proteinbindung verändert die Eigenschaften von Neutralrot und verändert sowohl seine Absorption als auch sein pKa. Nachdem Sie das Absorptionsspektrum von freiem Neutralrot bei mehreren pH-Werten gemessen haben, fügen Sie den Lösungen Riboflavin-bindendes Protein (RP) hinzu und messen die Absorptionen erneut.
Die Absorptionsintensität hängt mit der Konzentration zusammen, daher verwenden Sie die Spektren, um den pKa von freiem und gebundenem Neutralrot nach dem Labor zu bestimmen. Bevor Sie mit diesem Abschnitt beginnen, zeichnen Sie eine Tabelle in Ihrem Labornotizbuch, in der die Küvettenzahl, der pH-Wert des Puffers, die Extinktion bei Lambda Max für freies protoniertes Neutralrot und die Absorption bei Lambda Max für gebundenes protoniertes Neutralrot aufgeführt sind. Nummerieren Sie die Küvetten von 1 bis 10 und listen Sie die neun Puffer-pH-Werte auf, die Sie verwenden werden.
Die 10. Küvette wird ein deionisierter Wasserrohling sein. Halten Sie die Küvetten immer an den strukturierten Seiten und wischen Sie die transparenten Seiten ab, bevor Sie die Küvette in das Spektralphotometer einsetzen. Denken Sie daran, die transparenten Seiten mit dem Lichtstrahl im Spektralphotometer auszurichten.
Fangen wir nun an. Besorgen Sie sich zehn 1,5-Milliliter-Küvetten und -Verschlüsse und beschriften Sie die Kappen 1 bis 10, damit sie mit der Tabelle in Ihrem Labornotizbuch übereinstimmen. Beschriften Sie ein 25-Milliliter-Becherglas mit DIH2O' und füllen Sie es mit entionisiertem Wasser.
Spülen Sie dann Ihren neutralen wässrigen Abfall in den Abfluss und beschriften Sie den Becher in wässrigen Pufferabfall. Beschriften Sie außerdem ein 400-Milliliter-Becherglas für gebrauchte Mikropipettenspitzen. Befestigen Sie dann eine Spitze an einer 1-Milliliter-Mikropipette und geben Sie damit 1000 Mikroliter deionisiertes Wasser in die Küvette 10 ab. Dies wird Ihr Lösungsmittelrohling sein.
Werfen Sie nun die Spitze aus, stellen Sie die Mikropipette so ein, dass sie 925 Mikroliter abgibt, und setzen Sie eine neue Spitze ein. Geben Sie 925 Mikroliter Ihres Mononatriumphosphatpuffers mit einem pH-Wert von 7,0 in die fünfte Küvette. Werfen Sie die Spitze aus und verschließen Sie die Küvette.
Bringen Sie anschließend die restlichen leeren Küvetten in den Puffertisch. Geben Sie anhand der Tabelle in Ihrem Labornotizbuch 925 Mikroliter jedes Puffers mit den beschrifteten Mikropipetten in die entsprechende Küvette. Achten Sie darauf, nicht dieselbe Pipettenspitze für verschiedene Puffer zu verwenden.
Wenn du fertig bist, bringe die Puffer zurück zu deinem Arbeitsbereich. Stellen Sie dort eine 200-Mikroliter-Mikropipette so ein, dass sie 75 Mikroliter abgibt, und befestigen Sie eine Spitze an der Mikropipette. Besorge dir nun ein Fläschchen oder eine Tube mit neutralroter Lösung, die du mit einer anderen Schülergruppe teilen kannst.
Geben Sie 75 Mikroliter Neutralrot in jede der neun Pufferküvetten. Setzen Sie die Pipettenspitze wieder ein, wenn sie einen Puffer berührt. Werfen Sie die Pipettenspitze aus und verschließen Sie die Küvetten, wenn Sie fertig sind.
Drehen Sie nun jede Küvette mehrmals um, um die Lösungen gründlich zu vermischen. Wenn du Neutralrot mit jedem Puffer gemischt hast, mach ein Foto oder schreibe die Farben der Lösungen auf. Schalten Sie als Nächstes ein tragbares Spektralphotometer ein und warten Sie, bis sich die Lichtquelle erwärmt hat.
Sobald es fertig ist, erstellen Sie ein neues Experiment, um die Absorption in Abhängigkeit von der Wellenlänge für das freie Neutralrot zu messen. Setzen Sie dann die Küvette mit deionisiertem Wasser ein. Erfassen Sie ein Spektrum des deionisierten Wassers und stellen Sie es als Lösungsmittelhintergrund oder Leerzeichen ein.
Entfernen Sie dann den Rohling aus dem Spektralphotometer und setzen Sie die Küvette mit Neutralrot in den Puffer mit dem niedrigsten pH-Wert ein, der die höchste Konzentration an protoniertem Neutralrot aufweist. Erfassen Sie ein Spektrum, das einen starken Peak aufweisen sollte. Identifizieren Sie die Wellenlänge, die dem höchsten Punkt dieses Peaks oder dem Maximum entspricht.
Notieren Sie diese Wellenlänge in Ihrem Labornotizbuch als Lambda max für protoniertes freies Neutralrot. Speichern Sie die Daten und entfernen Sie die Küvette. Notieren Sie die Absorption in Ihrem Notizbuch und sammeln Sie dann Spektren für die Küvetten 2 bis 9 mit dem gleichen Verfahren.
Die Spektren sollten sich alle an einem einzigen Punkt kreuzen, dem sogenannten isosbestischen Punkt. Notieren Sie die Wellenlänge dieses Punktes in Ihrem Labornotizbuch. Wenn sich an dieser Stelle kein Spektrum kreuzt, leeren und reinigen Sie die Küvette, bereiten Sie eine frische Probe vor und versuchen Sie es erneut.
Wenn Sie mit dem Sammeln von Spektren für alle 9 Küvetten fertig sind, speichern und exportieren Sie die Daten. Erstellen Sie dann ein neues Experiment, um die Absorption über der Wellenlänge für das gebundene Neutralrot zu messen. Setzen Sie eine neue Spitze in die 200-Mikroliter-Mikropipette ein und erhalten Sie einen gemeinsamen Behälter mit Riboflavin-bindendem Protein.
Geben Sie 75 Mikroliter Riboflavin-bindende Proteinlösung in jede Küvette, einschließlich des Rohlings. Werfen Sie die Spitze aus, befestigen Sie die Küvettenkappen und drehen Sie die Küvette mehrmals um, um die Lösungen zu mischen. Setzen Sie nun die Küvette 10 in das Spektralphotometer ein und stellen Sie sie als Lösungsmittelrohling ein.
Erfassen Sie dann ein Spektrum der Probe mit dem niedrigsten pH-Wert und identifizieren Sie die Wellenlänge, die dem Maximum des intensivsten Peaks entspricht. Notieren Sie es in Ihrem Labornotizbuch als Lambda-Max von protoniertem Neutralrot. Erfassen Sie danach Spektren für die Küvetten 2 bis 9 auf die gleiche Weise wie für die freien neutralroten Proben.
Notieren Sie die Intensitäten bei Lambda max für protoniertes Neutralrot in Ihrer Tabelle, zusammen mit der Wellenlänge am isosbestischen Punkt. Wenn Sie fertig sind, speichern Sie Ihre Daten, exportieren Sie sie für eine spätere Analyse und schalten Sie das Spektralphotometer aus. Legen Sie die Mikropipetten, die Spitzenboxen, das pH-Meter und das Spektralphotometer weg.
Entsorgen Sie Ihre gebrauchten Pipettenspitzen in einem zugelassenen Abfallbehälter oder Mülleimer. Entleeren Sie nun die Küvetten in das wässrige Pufferabfallbecherglas und spülen Sie die Küvetten mit entionisiertem Wasser in das Becherglas ein. Entleeren Sie in Ihrem Abzug das überschüssige Natronlauge in den Grundabfall und spülen Sie den Messzylinder mit Wasser aus.
Spülen Sie den wässrigen Grundabfall zusammen mit den anderen wässrigen Abfällen mit reichlich Leitungswasser in den Abfluss. Waschen Sie Ihre Glaswaren, Küvettenverschlüsse und Rührstäbchen gemäß den Standardverfahren Ihres Labors. Reinigen Sie zum Schluss Ihre Arbeitsflächen mit einem feuchten Papiertuch und werfen Sie gebrauchte Papiertücher und Labortücher in den Labormüll.
Lassen Sie uns nun unsere Absorptionsdaten analysieren, um die pKa's von Neutralrot zu bestimmen. Stellen Sie zunächst beide Sätze von Intensitätsdaten mit der Absorptionsintensität bei Lambda max auf der y-Achse und dem pH-Wert auf der x-Achse dar, wobei die Punkte durch glatte Linien verbunden sind. Berechnen Sie dann für jede Datenreihe die Differenz zwischen der Anfangs- und der Endabsorptionsintensität.
Verwenden Sie dies, um die Absorption in der Mitte zwischen der Anfangs- und Endabsorption für jede Reihe oder die Absorptionsmittelpunkte zu berechnen. Ermitteln Sie nun, wo sich der Mittelpunkt auf jeder Linie befindet, und identifizieren Sie den pH-Wert an dieser Stelle. Diese pH-Werte sind die pKa's von freiem und gebundenem Neutralrot.
Hier sehen wir einen Anstieg von pKa um etwa 1 zwischen freiem und gebundenem Neutralrot, was darauf hindeutet, dass gebundenes protoniertes Neutralrot eine um eine Größenordnung schwächere Säure ist als freies protoniertes Neutralrot.
