Why is monosodium phosphate an effective buffer near pH 7?

Monosodium phosphate is effective near pH 7 because its pKa range is 6.8 to 7.2, which overlaps with the target pH. Buffers are most effective close to their pKa, where the weak acid and conjugate base are present in significant concentrations. This allows the buffer to resist pH changes when small amounts of acid or base are added.

What is the role of NaOH when preparing a monosodium phosphate buffer?

NaOH is added drop-wise to shift the equilibrium toward the conjugate base, disodium phosphate, without altering the overall buffer composition. Unadjusted monosodium phosphate solutions typically have a pH of 4–6, so NaOH raises the pH to the target value of 7.0 while maintaining the buffer's capacity to resist pH changes.

How do the protonated and deprotonated forms of neutral red differ in color and light absorption?

The protonated form of neutral red is red and absorbs green light, while the deprotonated form is yellow-orange and absorbs blue-violet light. These distinct absorption wavelengths allow researchers to track the ionization state of neutral red across different pH values using absorption spectroscopy.

How does protein binding affect the properties of neutral red?

Protein binding alters both the absorbance and pKa of neutral red. When riboflavin-binding protein binds to neutral red, the pKa increases by approximately one unit, indicating that bound-protonated neutral red is a weaker acid than free protonated neutral red by an order of magnitude.

What is the isosbestic point in an absorption spectrum?

The isosbestic point is the wavelength where all absorption spectra cross at a single point, regardless of pH. Recording this wavelength helps verify data quality and indicates a clean transition between the protonated and deprotonated forms of neutral red across the pH range tested.

How do you determine the pKa of neutral red from absorbance data?

Plot absorbance intensity at lambda max versus pH for both free and bound neutral red. Calculate the midpoint between the highest and lowest absorbance values, then find the pH at which this midpoint occurs on the plotted line. That pH value is the pKa of the compound.

Why is it important to handle cuvettes correctly during spectrophotometry?

Cuvettes must be held by their textured sides and have transparent sides wiped clean before measurement to ensure accurate absorbance readings. The transparent sides must align with the spectrophotometer's light beam. Proper handling prevents fingerprints and contamination that would interfere with light transmission and distort results.

Puffer

Konzepte Vorbereitung für Lehrkräfte Arbeitsanleitung für Studierende

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Puffer sind Lösungen, die darauf abzielen, einen konstanten pH-Wert in einem System aufrechtzuerhalten, unabhängig von der Zugabe starker Säuren oder Basen. In Ermangelung von Puffern verändert die Zugabe einer starken Säure oder einer Base zu einer Lösung den pH-Wert erheblich. Puffer sind im Alltag von entscheidender Bedeutung. Zum Beispiel wirkt Blut als Puffer und ist in der Lage, einen pH-Wert zwischen 7,35 und 7,45 aufrechtzuerhalten, da ein pH-Wert über 7,8 oder unter 6,8 zum Tod führen kann.

Wie funktioniert ein Puffer? Ein Puffer ist im Wesentlichen eine schwache Säure oder Base, deren konjugierte Base oder Säure sich im Gleichgewicht zueinander befindet. Nehmen wir zum Beispiel einen Puffer aus Essigsäure und Natriumacetat. Die Pufferlösung enthält eine schwache Säure und ihr konjugiertes Salz, das dissoziiert und die konjugierte Base Acetat bildet. Die Lösung ist sauer, weil das K_a der Essigsäure höher ist als das K_b der konjugierten Base.

Denken Sie daran, dass die Dissoziationskonstante K_a oder K_b die Stärke der Säure bzw. Base definiert, da sie die Gleichgewichtskonstante für die Dissoziation der Verbindung in Wasser ist. Die Dissoziationskonstante kann auch als pK_a oder negativer Logarithmus von K_a dargestellt werden, wobei die Säure umso stärker ist, je kleiner pK_a ist. Das Gleiche gilt für pK_b, wo die Basis umso stärker ist, je kleiner der pK_b ist.

Zurück zum Acetatpuffer: Wenn wir eine starke Base wie Natriumhydroxid hinzufügen, reagieren die Hydroxidionen mit den in der Lösung vorhandenen Hydroniumionen. Dies führt dazu, dass mehr Essigsäure mit Wasser reagiert, um wieder ins Gleichgewicht zu kommen, wodurch mehr Hydronium-Ionen gebildet werden. Wenn wir eine starke Säure wie Salzsäure hinzufügen, werden in Lösung mehr Hydronium-Ionen gebildet. Diese Ionen reagieren mit den Acetat-Ionen und bilden mehr Essigsäure. In beiden Fällen ändert sich der pH-Wert der Lösung nur sehr wenig.

Denken Sie daran, dass jeder Puffer einen bestimmten pH-Bereich hat, in dem er eine Lösung puffern kann. Hier zeigen wir eine Titrationskurve für unseren Essigsäurepuffer. Der Pufferbereich wird hervorgehoben. Dieser Bereich wird durch die Henderson-Hasselbalch-Gleichung bestimmt, die uns sagt, dass der pH-Wert des Puffers durch das K_a der schwachen Säure und das Verhältnis der konjugierten Base zur schwachen Säure bestimmt wird.

Weit entfernt von diesem pH-Wert ist die schwache Säure oder Base des Puffers erschöpft und kann den pH-Wert nicht puffern. Wenn Sie also einen Puffer für Ihre Anwendung auswählen, wählen Sie einen, dessen pK_a nahe am gewünschten pH-Wert liegt.

Schließlich haben alle Puffer eine Grenze für ihre Pufferkapazität, d. h. die Menge an Säure oder einer Base, die der Pufferlösung zugesetzt werden kann, bevor sich der pH-Wert signifikant ändert. Wenn wir zum Beispiel zu viel Säure zu unserer Essigsäure- und Natriumacetat-Pufferlösung hinzufügen, protonieren wir alle Acetationen und reichern viele Hydroniumionen an, wodurch der pH-Wert gesenkt wird.

Wenn wir zu viel Base hinzufügen, deprotonieren wir die gesamte Essigsäure und sammeln viele Hydroxidionen an, wodurch der pH-Wert erhöht wird. Die Pufferkapazität wird also durch die Konzentration der schwachen Säure und des konjugierten Salzes beeinflusst. Ein 1-molarer Acetat-Puffer hat also eine höhere Pufferkapazität als ein 0,1-molarer Acetat-Puffer.

In diesem Labor bereiten Sie Puffer mit einer Vielzahl von pH-Bereichen vor und untersuchen sie. Anschließend verwenden Sie Ihre Puffer, um den pK_a eines pH-Indikators zu bestimmen, der als Neutralrot bezeichnet wird, und untersuchen die Veränderung des pK_a von Neutralrot, wenn das Riboflavin-Bindungsprotein eingeführt wird.

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Quelle: Smaa Koraym von der Johns Hopkins University, MD, USA

Vorbereitung von 50 mM NaH₂PO₄ Puffer, pH 7

Im ersten Teil dieses Experiments bereiten Sie eine Natriumphosphatlösung her, die bei einem pH-Wert von 7,0 gepuffert ist. Mononatriumphosphat ist eine schwache Säure mit der konjugierten Base Dinatriumphosphat. Uneingestellte Mononatriumphosphatlösungen haben in der Regel einen pH-Wert von etwa 4 - 6.

Puffer sind am effektivsten in der Nähe ihres pKa, der für Mononatriumphosphat bei 6,8 bis 7,2 liegt. Sie werden also NaOH verwenden, um das Gleichgewicht in Richtung der konjugierten Basis zu verschieben, ohne die Gesamtzusammensetzung des Puffergleichgewichts zu verändern.

Bevor Sie das Experiment starten, berechnen Sie die Masse an Mononatriumphosphat, die Sie benötigen, um 200 mL einer 50 mM Lösung herzustellen.

Tabelle 1: Aufbereitung von 50 mM NaH₂PO₄ Puffer, pH 7,0

Molmasse von NaH₂PO₄ = 119,98 g/mol
Volumen der Lösung (ml)	200
Molarität (mM)	50
Mol von NaH₂PO₄ (mol)
Benötigte Masse (mg)
Anfangsvolumen von 1 M NaOH (mL)
Endvolumen von 1 M NaOH (mL)
Volumen des verwendeten NaOH (ml)
Volumen des benötigten DI-Wassers (ml)

Klicken Sie hier, um Tabelle 1 herunterzuladen

Um zu beginnen, ziehen Sie die notwendige persönliche Schutzausrüstung an, einschließlich eines Laborkittels, einer spritzwassergeschützten Schutzbrille und Handschuhen. Anmerkung: In diesem Bereich des Labors wird NaOH verwendet, das korrosiv und giftig ist. Seien Sie vorsichtig beim Gießen und Transportieren von NaOH.
Füllen Sie eine 250-ml-Plastikwaschflasche mit deionisiertem Wasser.
Beschriften Sie zwei 100-ml-Becher, eines für neutrale wässrige Abfälle und eines für basische wässrige Abfälle.
Kalibrieren Sie Ihr pH-Messgerät mit den bereitgestellten Puffern. Bewahren Sie die Sonde in ihrer Aufbewahrungslösung auf, wenn Sie fertig sind.
Tarieren Sie das Wägepapier und verwenden Sie einen sauberen Spatel, um die erforderliche Menge an Mononatriumphosphat gemäß Ihren Berechnungen abzumessen. Notieren Sie die genaue Menge an Mononatriumphosphat in Ihrem Labornotizbuch. Anmerkung: Mononatriumphosphat absorbiert Feuchtigkeit aus der Luft, also arbeiten Sie schnell, um eine genaue Messung zu erhalten, und verschließen Sie den Behälter fest, wenn Sie damit fertig sind.
Geben Sie das Mononatriumphosphat in ein 400-ml-Becherglas und reinigen Sie den Spatel mit einem Labortuch. Werfen Sie das Wägepapier und das Labortuch weg, bevor Sie zu Ihrem Abzug zurückkehren.
Verwenden Sie einen Messzylinder, um 175 mL deionisiertes Wasser abzumessen. Gießen Sie das Wasser in das Becherglas mit Mononatriumphosphat und fügen Sie einen magnetischen Rührstab hinzu.
Rühren Sie die Lösung, bis sich das Salz vollständig aufgelöst hat und die Lösung homogen erscheint. Dies dauert in der Regel 2 - 3 Minuten.
Messen Sie 15 mL deionisiertes Wasser und gießen Sie es in das Becherglas. Rühren Sie die Lösung weiter, bis sie wieder homogen erscheint (ca. 1 – 2 min). Schalten Sie den Rührmotor aus.
Spülen Sie die pH-Sonde mit deionisiertem Wasser und klemmen Sie sie dann mit dem Sensor über dem Rührstab in die Lösung.
Bringen Sie einen 10-ml-Messzylinder und ein Uhrglas zur Abgabehaube und messen Sie 10 ml 1 M NaOH ab. Notieren Sie sich das genaue Volumen im Messzylinder.
Decken Sie Ihr NaOH mit dem Uhrenglas ab und bringen Sie es vorsichtig zu Ihrem Abzug.
Setze das Rühren der Mononatriumphosphatlösung fort. Während Sie den pH-Wert überwachen, verwenden Sie eine Einwegpipette, um NaOH langsam tropfenweise zur Rührlösung hinzuzufügen. Sobald der pH-Wert des Puffers 7,0 erreicht, geben Sie das noch in der Pipette befindliche NaOH in den Messzylinder zurück.
Berechnen Sie das Volumen von NaOH, das Sie dem Puffer hinzugefügt haben. Subtrahieren Sie dieses Volumen von 10 ml, um zu bestimmen, wie viel deionisiertes Wasser Sie zu Ihrem Puffer hinzufügen müssen, um ein Gesamtlösungsvolumen von 200 mL zu erreichen.
Messen Sie das deionisierte Wasser mit einem weiteren 10-ml-Messzylinder und geben Sie es zur Rührlösung, um die Herstellung des Puffers abzuschließen.
Spülen Sie den pH-Sensor mit deionisiertem Wasser, decken Sie ihn mit der mit der Vorratslösung gefüllten Kappe ab und ziehen Sie den Netzstecker oder schalten Sie die Sonde aus.
Kennzeichnen Sie eine 250-ml-Polyethylenflasche als '50 mM Mononatriumphosphatpuffer, pH 7,0'. Nehmen Sie den magnetischen Rührstab aus der Lösung.
Verwenden Sie einen Trichter, um die Pufferlösung in die etikettierte Flasche zu gießen und sie fest zu verschließen.

Absorptionsspektroskopie von freien und gebundenen neutralen Red
Puffer können verwendet werden, um Verbindungen bei bestimmten pH-Werten zu bewerten. In diesem Abschnitt erfassen Sie das Absorptionsspektrum des Indikators Neutralrot in verschiedenen Puffern. Die protonierte Form von Neutralrot ist Rot und die deprotonierte Form ist gelb-orange, was bedeutet, dass sie grünes bzw. blau-violettes Licht absorbieren. Die saure und die basische Form weisen also unterschiedliche Absorptionswellenlängen auf. Die Proteinbindung verändert die Eigenschaften von Neutralrot und verändert sowohl seine Absorption als auch sein pKa.

Nachdem Sie das Absorptionsspektrum von freiem Neutralrot bei mehreren pH-Werten gemessen haben, fügen Sie den Lösungen Riboflavin-bindendes Protein (RP) hinzu und messen die Absorptionen erneut. Die Absorptionsintensität hängt mit der Konzentration zusammen, daher verwenden Sie die Spektren, um den pKa von freiem und gebundenem Neutralrot nach dem Labor zu bestimmen.
- Zeichnen Sie die folgende Tabelle in Ihr Labornotizbuch. Nummerieren Sie die Küvetten von 1 bis 10 und listen Sie die neun Puffer-pH-Werte auf, die Sie verwenden werden. Die 10. Küvette wird ein deionisierter Wasserrohling sein. Anmerkung: Halten Sie die Küvetten immer an den strukturierten Seiten und wischen Sie die transparenten Seiten ab, bevor Sie die Küvette in das Spektralphotometer einsetzen. Denken Sie daran, die transparenten Seiten mit dem Lichtstrahl im Spektralphotometer auszurichten.
  Tabelle 2: Absorption von freiem und gebundenem Neutralrot
  
  Küvette # Puffer pH Abs. bei_{λ max}(Freies NRH⁺) Abs. bei_{λ max} (Bound NRH)
  1 5.0
  2 5.5
  3 6.0
  4 6.5
  5 7.0
  6 7.5
  7 8.0
  8 8.5
  9 11
  10 leer
  Klicken Sie hier, um Tabelle 2 herunterzuladen
- Besorgen Sie sich zehn 1,5-ml-Küvetten und -Kappen und beschriften Sie die Kappen 1 bis 10, damit sie mit der Tabelle in Ihrem Labornotizbuch übereinstimmen.
- Beschriften Sie ein 25-ml-Becherglas mit 'DIH2O' und füllen Sie es mit deionisiertem Wasser.
- Spülen Sie Ihren neutralen wässrigen Abfall in den Abfluss und beschriften Sie das Becherglas in 'wässriger Pufferabfall'.
- Beschriften eines 400-ml-Bechers für gebrauchte Mikropipettenspitzen.
- Setze eine Spitze auf eine 1-ml-Mikropipette und gib damit 1000 μl deionisiertes Wasser in die Küvette 10. Dies ist Ihr Lösungsmittelrohling.
- Geben Sie 925 μl Ihres pH 7,0 Mononatriumphosphat-Puffers in Küvette 5.
- Bringt die restlichen leeren Küvetten in die Puffertabelle. Geben Sie anhand der Tabelle in Ihrem Labornotizbuch 925 μl jedes Puffers mit den beschrifteten Mikropipetten in die entsprechende Küvette. Achten Sie darauf, nicht dieselbe Pipettenspitze für verschiedene Puffer zu verwenden.
- Sobald Sie fertig sind, bringen Sie die Puffer zurück zu Ihrem Arbeitsbereich. Stellen Sie dort eine 200-μl-Mikropipette so ein, dass sie 75 μl dispensiert, und befestigen Sie eine Spitze an der Mikropipette.
- Geben Sie 75 μl Neutralrot in jede der neun Pufferküvetten. Jede Küvette mehrmals umdrehen, um die Lösungen gründlich zu vermischen. Anmerkung: Setzen Sie die Pipettenspitze wieder ein, wenn sie einen Puffer berührt.
- Sobald Sie Neutralrot mit jedem Puffer gemischt haben, machen Sie ein Foto oder notieren Sie die Farben der Lösungen.
- Schalten Sie ein tragbares Spektralphotometer ein und lassen Sie die Lichtquelle aufwärmen. Sobald es fertig ist, erstellen Sie ein neues Experiment, um die Absorption in Abhängigkeit von der Wellenlänge für das freie Neutralrot zu messen.
- Setze die Küvette mit deionisiertem Wasser ein und erhalte ein Spektrum des deionisierten Wassers. Legen Sie es als Lösungsmittelhintergrund oder als Leerzeichen fest.
- Entfernen Sie dann den Rohling und setzen Sie die Küvette mit Neutralrot in den Puffer mit dem niedrigsten pH-Wert ein, der die höchste Konzentration an protoniertem Neutralrot aufweist.
- Erfassen Sie ein Spektrum, das einen starken Peak aufweisen sollte. Identifizieren Sie die Wellenlänge, die dem höchsten Punkt dieses Peaks oder dem Maximum entspricht. Notieren Sie diese Wellenlänge in Ihrem Labornotizbuch als Lambda max für protoniertes freies Neutralrot.
- Speichern Sie die Daten und entfernen Sie die Küvette. Notieren Sie die Absorption in Ihrem Notizbuch und sammeln Sie dann Spektren für die Küvetten 2 - 9 mit dem gleichen Verfahren.
- Zeichnen Sie die Wellenlänge des isosbestischen Punktes in Ihrem Labornotizbuch auf. Das ist der Punkt, an dem sich alle Spektren bei einer einzigen Wellenlänge kreuzen. Wenn sich an dieser Stelle kein Spektrum kreuzt, leeren und reinigen Sie die Küvette, bereiten Sie eine frische Probe vor und versuchen Sie es erneut.
- Sobald Sie mit dem Sammeln von Spektren für alle neun Küvetten fertig sind, speichern und exportieren Sie die Daten.
- Erstellen Sie ein neues Experiment, um die Absorption über die Wellenlänge für das gebundene Neutralrot zu messen.
- Setze eine neue Spitze in die 200-μL-Mikropipette ein und füge 75 μl Riboflavin-bindende Proteinlösung zu jeder Küvette, einschließlich des Rohlings, hinzu. Werfen Sie die Spitze aus, befestigen Sie die Küvettenkappen und drehen Sie die Küvette mehrmals um, um die Lösungen zu mischen.
- Setzen Sie die Küvette 10 in das Spektralphotometer ein und stellen Sie sie als Lösungsmittelrohling ein.
- Erfassen Sie ein Spektrum der Probe mit dem niedrigsten pH-Wert und identifizieren Sie die Wellenlänge, die dem Maximum des intensivsten Peaks entspricht. Notieren Sie es in Ihrem Labornotizbuch als Lambda-Max von protoniertem Neutralrot.
- Erfassen Sie Spektren für die Küvetten 2 - 9 auf die gleiche Weise wie für die freien neutralen roten Proben. Notieren Sie die Intensitäten bei Lambda max für protoniertes Neutralrot in Ihrer Tabelle, zusammen mit der Wellenlänge am isosbestischen Punkt.
- Wenn Sie fertig sind, speichern Sie Ihre Daten, exportieren Sie sie für eine spätere Analyse und schalten Sie das Spektralphotometer aus.
- Räumen Sie alle Geräte weg und entsorgen Sie Ihre gebrauchten Pipettenspitzen in einem zugelassenen Abfallbehälter oder Mülleimer.
- Entleeren Sie die Küvetten in das wässrige Pufferabfallbecherglas und spülen Sie die Küvetten in das Becherglas mit entionisiertem Wasser.
- Entleeren Sie das überschüssige NaOH in den Grundabfall und spülen Sie den Messzylinder mit Wasser aus.
- Spülen Sie den wässrigen Grundabfall zusammen mit dem anderen wässrigen Abfall mit reichlich Leitungswasser in den Abfluss.
- Waschen Sie Ihre Glaswaren, Küvettenverschlüsse und Rührstäbchen gemäß den üblichen Verfahren Ihres Labors. Reinigen Sie Ihre Arbeitsflächen mit einem feuchten Papiertuch und werfen Sie gebrauchte Papiertücher und Labortücher in den Labormüll
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Results
Lassen Sie uns nun unsere Absorptionsdaten analysieren, um die pKa's von Neutralrot zu bestimmen.

Tabelle 3: Bestimmung der neutralroten pKa's

Kostenlos NRH⁺ Gebunden NRH⁺
λ_max (nm)
ΔA (nm)
Mittelpunkt (nm)
pKa

Klicken Sie hier, um Tabelle 3 herunterzuladen
- Plottet beide Sätze von Intensitätsdaten mit der Absorptionsintensität bei Lambda max auf der y-Achse und dem pH-Wert auf der x-Achse, wobei die Punkte durch glatte Linien verbunden sind.
- Berechnet die Differenz zwischen der Anfangs- und der Endabsorptionsintensität für jede Datenreihe.
- Bestimmen Sie die Absorption in der Mitte zwischen der Anfangs- und Endabsorption für jede Serie, oder die Absorptionsmittelpunkte.
- Finde heraus, wo der Mittelpunkt auf jeder Linie liegt und identifiziere den pH-Wert an diesem Punkt. Diese pH-Werte sind die pKa's von freiem und gebundenem Neutralrot.
- Hier sehen wir einen Anstieg des pKa um etwa eins zwischen freiem und gebundenem Neutralrot, was darauf hindeutet, dass gebundenes protoniertes Neutralrot eine um eine Größenordnung schwächere Säure ist als freies protoniertes Neutralrot.