Warum ist Mononatriumphosphat ein effektiver Puffer bei einem pH-Wert von 7?

Mononatriumphosphat ist nahe einem pH-Wert von 7 effektiv, da sein pKa-Bereich 6,8 bis 7,2 beträgt, was mit dem Ziel-pH-Wert überlappt. Puffer sind am effektivsten in der Nähe ihres pKa, wo die schwache Säure und die konjugierte Base in signifikanten Konzentrationen vorhanden sind. Dies ermöglicht es dem Puffer, pH-Änderungen zu widerstehen, wenn kleine Mengen an Säure oder Base hinzugefügt werden.

Was ist die Rolle von NaOH bei der Herstellung eines Natriumphosphat-Puffers?

NaOH wird tropfenweise hinzugefügt, um das Gleichgewicht in Richtung der konjugierten Base, Dinatriumphosphat, zu verschieben, ohne die gesamte Pufferzusammensetzung zu verändern. Unangepasste Mononatriumphosphat-Lösungen haben typischerweise einen pH-Wert von 4–6, sodass NaOH den pH-Wert auf den Zielwert von 7,0 anhebt und dabei die Fähigkeit des Puffers, pH-Veränderungen zu widerstehen, aufrechterhält.

Wie unterscheiden sich die protonierte und deprotonierte Form von Neutralrot in Farbe und Lichtabsorption?

Die protonierte Form von Neutralrot ist rot und absorbiert grünes Licht, während die deprotonierte Form gelb-orange ist und blau-violettes Licht absorbiert. Diese unterschiedlichen Absorptionswellenlängen ermöglichen es Forschern, den Ionisationszustand von Neutralrot bei verschiedenen pH-Werten mittels Absorptionsspektroskopie zu verfolgen.

Wie wirkt sich die Proteinbindung auf die Eigenschaften von Neutralrot aus?

Die Proteinbindung verändert sowohl die Absorption als auch den pKa von neutralem Rot. Wenn Riboflavin-bindendes Protein an neutrales Rot bindet, erhöht sich der pKa um etwa eine Einheit, was darauf hinweist, dass gebundenes-protoniertes neutrales Rot eine schwächere Säure ist als freies protoniertes neutrales Rot um eine Größenordnung.

Was ist der isosbestische Punkt in einem Absorptionsspektrum?

Der isosbestische Punkt ist die Wellenlänge, bei der alle Absorptionsspektren unabhängig vom pH-Wert an einem einzigen Punkt einander kreuzen. Die Aufzeichnung dieser Wellenlänge hilft bei der Überprüfung der Datenqualität und zeigt einen sauberen Übergang zwischen den protonierten und deprotonierten Formen des neutralen Rots über den getesteten pH-Bereich an.

Wie bestimmt man den pKa-Wert von Neutralrot aus Absorbanzdaten?

Plotten Sie die Absorptionsintensität bei Lambda max gegen den pH-Wert für sowohl freien als auch gebundenen neutralen rot. Berechnen Sie den Mittelpunkt zwischen den höchsten und niedrigsten Absorptionswerten und finden Sie dann den pH-Wert, bei dem dieser Mittelpunkt auf der gezeichneten Linie auftritt. Dieser pH-Wert ist der pKa-Wert der Verbindung.

Warum ist es wichtig, Küvetten während der Spektrophotometrie korrekt zu handhaben?

Küvetten müssen an ihren strukturierten Seiten gehalten und die transparenten Seiten vor der Messung sauber abgewischt werden, um genaue Absorptionsmessungen zu gewährleisten. Die transparenten Seiten müssen mit dem Lichtstrahl des Spektrophotometers ausgerichtet sein. Ordnungsgemäße Handhabung verhindert Fingerabdrücke und Verunreinigungen, die die Lichttransmission stören und die Ergebnisse verfälschen würden.

Puffer

Konzepte Vorbereitung für Lehrkräfte Arbeitsanleitung für Studierende

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Puffer sind Lösungen, die darauf abzielen, einen konstanten pH-Wert in einem System aufrechtzuerhalten, unabhängig von der Zugabe starker Säuren oder Basen. In Ermangelung von Puffern verändert die Zugabe einer starken Säure oder einer Base zu einer Lösung den pH-Wert erheblich. Puffer sind im Alltag von entscheidender Bedeutung. Zum Beispiel wirkt Blut als Puffer und ist in der Lage, einen pH-Wert zwischen 7,35 und 7,45 aufrechtzuerhalten, da ein pH-Wert über 7,8 oder unter 6,8 zum Tod führen kann.

Wie funktioniert ein Puffer? Ein Puffer ist im Wesentlichen eine schwache Säure oder Base, deren konjugierte Base oder Säure sich im Gleichgewicht zueinander befindet. Nehmen wir zum Beispiel einen Puffer aus Essigsäure und Natriumacetat. Die Pufferlösung enthält eine schwache Säure und ihr konjugiertes Salz, das dissoziiert und die konjugierte Base Acetat bildet. Die Lösung ist sauer, weil das K_a der Essigsäure höher ist als das K_b der konjugierten Base.

Denken Sie daran, dass die Dissoziationskonstante K_a oder K_b die Stärke der Säure bzw. Base definiert, da sie die Gleichgewichtskonstante für die Dissoziation der Verbindung in Wasser ist. Die Dissoziationskonstante kann auch als pK_a o

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Quelle: Smaa Koraym von der Johns Hopkins University, MD, USA

Vorbereitung von 50 mM NaH₂PO₄ Puffer, pH 7

Im ersten Teil dieses Experiments bereiten Sie eine Natriumphosphatlösung her, die bei einem pH-Wert von 7,0 gepuffert ist. Mononatriumphosphat ist eine schwache Säure mit der konjugierten Base Dinatriumphosphat. Uneingestellte Mononatriumphosphatlösungen haben in der Regel einen pH-Wert von etwa 4 - 6.

Puffer sind am effektivsten in der Nähe ihres pKa, der für Mononatriumphosphat bei 6,8 bis 7,2 liegt. Sie werden also NaOH verwenden, um das Gleichgewicht in Richtung der konjugierten Basis zu verschieben, ohne die Gesamtzusammensetzung des Puffergleichgewichts zu verändern.

Bevor Sie das Experiment starten, berechnen Sie die Masse an Mononatriumphosphat, die Sie benötigen, um 200 mL einer 50 mM Lösung herzustellen.

Tabelle 1: Aufbereitung von 50 mM NaH₂PO₄ Puffer, pH 7,0

Molmasse von NaH₂PO₄ = 119,98 g/mol
Volumen der Lösung (ml)	200
Molarität (mM)	50
Mol von NaH₂PO₄ (mol)
Benötigte Masse (mg)
Anfangsvolumen von 1 M NaOH (mL)
Endvolumen von 1 M NaOH (mL)
Volumen des verwendeten NaOH (ml)
Volumen des benötigten DI-Wassers (ml)

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Um zu beginnen, ziehen Sie die notwendige persönliche Schutzausrüstung an, einschließlich eines Laborkittels, einer spritzwassergeschützten Schutzbrille und Handschuhen. Anmerkung: In diesem Bereich des Labors wird NaOH verwendet, das korrosiv und giftig ist. Seien Sie vorsichtig beim Gießen und Transportieren von NaOH.
Füllen Sie eine 250-ml-Plastikwaschflasche mit deionisiertem Wasser.
Beschriften Sie zwei 100-ml-Becher, eines für neutrale wässrige Abfälle und eines für basische wässrige Abfälle.
Kalibrieren Sie Ihr pH-Messgerät mit den bereitgestellten Puffern. Bewahren Sie die Sonde in ihrer Aufbewahrungslösung auf, wenn Sie fertig sind.
Tarieren Sie das Wägepapier und verwenden Sie einen sauberen Spatel, um die erforderliche Menge an Mononatriumphosphat gemäß Ihren Berechnungen abzumessen. Notieren Sie die genaue Menge an Mononatriumphosphat in Ihrem Labornotizbuch. Anmerkung: Mononatriumphosphat absorbiert Feuchtigkeit aus der Luft, also arbeiten Sie schnell, um eine genaue Messung zu erhalten, und verschließen Sie den Behälter fest, wenn Sie damit fertig sind.
Geben Sie das Mononatriumphosphat in ein 400-ml-Becherglas und reinigen Sie den Spatel mit einem Labortuch. Werfen Sie das Wägepapier und das Labortuch weg, bevor Sie zu Ihrem Abzug zurückkehren.
Verwenden Sie einen Messzylinder, um 175 mL deionisiertes Wasser abzumessen. Gießen Sie das Wasser in das Becherglas mit Mononatriumphosphat und fügen Sie einen magnetischen Rührstab hinzu.
Rühren Sie die Lösung, bis sich das Salz vollständig aufgelöst hat und die Lösung homogen erscheint. Dies dauert in der Regel 2 - 3 Minuten.
Messen Sie 15 mL deionisiertes Wasser und gießen Sie es in das Becherglas. Rühren Sie die Lösung weiter, bis sie wieder homogen erscheint (ca. 1 – 2 min). Schalten Sie den Rührmotor aus.
Spülen Sie die pH-Sonde mit deionisiertem Wasser und klemmen Sie sie dann mit dem Sensor über dem Rührstab in die Lösung.
Bringen Sie einen 10-ml-Messzylinder und ein Uhrglas zur Abgabehaube und messen Sie 10 ml 1 M NaOH ab. Notieren Sie sich das genaue Volumen im Messzylinder.
Decken Sie Ihr NaOH mit dem Uhrenglas ab und bringen Sie es vorsichtig zu Ihrem Abzug.
Setze das Rühren der Mononatriumphosphatlösung fort. Während Sie den pH-Wert überwachen, verwenden Sie eine Einwegpipette, um NaOH langsam tropfenweise zur Rührlösung hinzuzufügen. Sobald der pH-Wert des Puffers 7,0 erreicht, geben Sie das noch in der Pipette befindliche NaOH in den Messzylinder zurück.
Berechnen Sie das Volumen von NaOH, das Sie dem Puffer hinzugefügt haben. Subtrahieren Sie dieses Volumen von 10 ml, um zu bestimmen, wie viel deionisiertes Wasser Sie zu Ihrem Puffer hinzufügen müssen, um ein Gesamtlösungsvolumen von 200 mL zu erreichen.
Messen Sie das deionisierte Wasser mit einem weiteren 10-ml-Messzylinder und geben Sie es zur Rührlösung, um die Herstellung des Puffers abzuschließen.
Spülen Sie den pH-Sensor mit deionisiertem Wasser, decken Sie ihn mit der mit der Vorratslösung gefüllten Kappe ab und ziehen Sie den Netzstecker oder schalten Sie die Sonde aus.
Kennzeichnen Sie eine 250-ml-Polyethylenflasche als '50 mM Mononatriumphosphatpuffer, pH 7,0'. Nehmen Sie den magnetischen Rührstab aus der Lösung.
Verwenden Sie einen Trichter, um die Pufferlösung in die etikettierte Flasche zu gießen und sie fest zu verschließen.

Absorptionsspektroskopie von freien und gebundenen neutralen Red
Puffer können verwendet werden, um Verbindungen bei bestimmten pH-Werten zu bewerten. In diesem Abschnitt erfassen Sie das Absorptionsspektrum des Indikators Neutralrot in verschiedenen Puffern. Die protonierte Form von Neutralrot ist Rot und die deprotonierte Form ist gelb-orange, was bedeutet, dass sie grünes bzw. blau-violettes Licht absorbieren. Die saure und die basische Form weisen also unterschiedliche Absorptionswellenlängen auf. Die Proteinbindung verändert die Eigenschaften von Neutralrot und verändert sowohl seine Absorption als auch sein pKa.

Nachdem Sie das Absorptionsspektrum von freiem Neutralrot bei mehreren pH-Werten gemessen haben, fügen Sie den Lösungen Riboflavin-bindendes Protein (RP) hinzu und messen die Absorptionen erneut. Die Absorptionsintensität hängt mit der Konzentration zusammen, daher verwenden Sie die Spektren, um den pKa von freiem und gebundenem Neutralrot nach dem Labor zu bestimmen.
- Zeichnen Sie die folgende Tabelle in Ihr Labornotizbuch. Nummerieren Sie die Küvetten von 1 bis 10 und listen Sie die neun Puffer-pH-Werte auf, die Sie verwenden werden. Die 10. Küvette wird ein deionisierter Wasserrohling sein. Anmerkung: Halten Sie die Küvetten immer an den strukturierten Seiten und wischen Sie die transparenten Seiten ab, bevor Sie die Küvette in das Spektralphotometer einsetzen. Denken Sie daran, die transparenten Seiten mit dem Lichtstrahl im Spektralphotometer auszurichten.
  Tabelle 2: Absorption von freiem und gebundenem Neutralrot
  
  Küvette # Puffer pH Abs. bei_{λ max}(Freies NRH⁺) Abs. bei_{λ max} (Bound NRH)
  1 5.0
  2 5.5
  3 6.0
  4 6.5
  5 7.0
  6 7.5
  7 8.0
  8 8.5
  9 11
  10 leer
  Klicken Sie hier, um Tabelle 2 herunterzuladen
- Besorgen Sie sich zehn 1,5-ml-Küvetten und -Kappen und beschriften Sie die Kappen 1 bis 10, damit sie mit der Tabelle in Ihrem Labornotizbuch übereinstimmen.
- Beschriften Sie ein 25-ml-Becherglas mit 'DIH2O' und füllen Sie es mit deionisiertem Wasser.
- Spülen Sie Ihren neutralen wässrigen Abfall in den Abfluss und beschriften Sie das Becherglas in 'wässriger Pufferabfall'.
- Beschriften eines 400-ml-Bechers für gebrauchte Mikropipettenspitzen.
- Setze eine Spitze auf eine 1-ml-Mikropipette und gib damit 1000 μl deionisiertes Wasser in die Küvette 10. Dies ist Ihr Lösungsmittelrohling.
- Geben Sie 925 μl Ihres pH 7,0 Mononatriumphosphat-Puffers in Küvette 5.
- Bringt die restlichen leeren Küvetten in die Puffertabelle. Geben Sie anhand der Tabelle in Ihrem Labornotizbuch 925 μl jedes Puffers mit den beschrifteten Mikropipetten in die entsprechende Küvette. Achten Sie darauf, nicht dieselbe Pipettenspitze für verschiedene Puffer zu verwenden.
- Sobald Sie fertig sind, bringen Sie die Puffer zurück zu Ihrem Arbeitsbereich. Stellen Sie dort eine 200-μl-Mikropipette so ein, dass sie 75 μl dispensiert, und befestigen Sie eine Spitze an der Mikropipette.
- Geben Sie 75 μl Neutralrot in jede der neun Pufferküvetten. Jede Küvette mehrmals umdrehen, um die Lösungen gründlich zu vermischen. Anmerkung: Setzen Sie die Pipettenspitze wieder ein, wenn sie einen Puffer berührt.
- Sobald Sie Neutralrot mit jedem Puffer gemischt haben, machen Sie ein Foto oder notieren Sie die Farben der Lösungen.
- Schalten Sie ein tragbares Spektralphotometer ein und lassen Sie die Lichtquelle aufwärmen. Sobald es fertig ist, erstellen Sie ein neues Experiment, um die Absorption in Abhängigkeit von der Wellenlänge für das freie Neutralrot zu messen.
- Setze die Küvette mit deionisiertem Wasser ein und erhalte ein Spektrum des deionisierten Wassers. Legen Sie es als Lösungsmittelhintergrund oder als Leerzeichen fest.
- Entfernen Sie dann den Rohling und setzen Sie die Küvette mit Neutralrot in den Puffer mit dem niedrigsten pH-Wert ein, der die höchste Konzentration an protoniertem Neutralrot aufweist.
- Erfassen Sie ein Spektrum, das einen starken Peak aufweisen sollte. Identifizieren Sie die Wellenlänge, die dem höchsten Punkt dieses Peaks oder dem Maximum entspricht. Notieren Sie diese Wellenlänge in Ihrem Labornotizbuch als Lambda max für protoniertes freies Neutralrot.
- Speichern Sie die Daten und entfernen Sie die Küvette. Notieren Sie die Absorption in Ihrem Notizbuch und sammeln Sie dann Spektren für die Küvetten 2 - 9 mit dem gleichen Verfahren.
- Zeichnen Sie die Wellenlänge des isosbestischen Punktes in Ihrem Labornotizbuch auf. Das ist der Punkt, an dem sich alle Spektren bei einer einzigen Wellenlänge kreuzen. Wenn sich an dieser Stelle kein Spektrum kreuzt, leeren und reinigen Sie die Küvette, bereiten Sie eine frische Probe vor und versuchen Sie es erneut.
- Sobald Sie mit dem Sammeln von Spektren für alle neun Küvetten fertig sind, speichern und exportieren Sie die Daten.
- Erstellen Sie ein neues Experiment, um die Absorption über die Wellenlänge für das gebundene Neutralrot zu messen.
- Setze eine neue Spitze in die 200-μL-Mikropipette ein und füge 75 μl Riboflavin-bindende Proteinlösung zu jeder Küvette, einschließlich des Rohlings, hinzu. Werfen Sie die Spitze aus, befestigen Sie die Küvettenkappen und drehen Sie die Küvette mehrmals um, um die Lösungen zu mischen.
- Setzen Sie die Küvette 10 in das Spektralphotometer ein und stellen Sie sie als Lösungsmittelrohling ein.
- Erfassen Sie ein Spektrum der Probe mit dem niedrigsten pH-Wert und identifizieren Sie die Wellenlänge, die dem Maximum des intensivsten Peaks entspricht. Notieren Sie es in Ihrem Labornotizbuch als Lambda-Max von protoniertem Neutralrot.
- Erfassen Sie Spektren für die Küvetten 2 - 9 auf die gleiche Weise wie für die freien neutralen roten Proben. Notieren Sie die Intensitäten bei Lambda max für protoniertes Neutralrot in Ihrer Tabelle, zusammen mit der Wellenlänge am isosbestischen Punkt.
- Wenn Sie fertig sind, speichern Sie Ihre Daten, exportieren Sie sie für eine spätere Analyse und schalten Sie das Spektralphotometer aus.
- Räumen Sie alle Geräte weg und entsorgen Sie Ihre gebrauchten Pipettenspitzen in einem zugelassenen Abfallbehälter oder Mülleimer.
- Entleeren Sie die Küvetten in das wässrige Pufferabfallbecherglas und spülen Sie die Küvetten in das Becherglas mit entionisiertem Wasser.
- Entleeren Sie das überschüssige NaOH in den Grundabfall und spülen Sie den Messzylinder mit Wasser aus.
- Spülen Sie den wässrigen Grundabfall zusammen mit dem anderen wässrigen Abfall mit reichlich Leitungswasser in den Abfluss.
- Waschen Sie Ihre Glaswaren, Küvettenverschlüsse und Rührstäbchen gemäß den üblichen Verfahren Ihres Labors. Reinigen Sie Ihre Arbeitsflächen mit einem feuchten Papiertuch und werfen Sie gebrauchte Papiertücher und Labortücher in den Labormüll
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Results
Lassen Sie uns nun unsere Absorptionsdaten analysieren, um die pKa's von Neutralrot zu bestimmen.

Tabelle 3: Bestimmung der neutralroten pKa's

Kostenlos NRH⁺ Gebunden NRH⁺
λ_max (nm)
ΔA (nm)
Mittelpunkt (nm)
pKa

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- Plottet beide Sätze von Intensitätsdaten mit der Absorptionsintensität bei Lambda max auf der y-Achse und dem pH-Wert auf der x-Achse, wobei die Punkte durch glatte Linien verbunden sind.
- Berechnet die Differenz zwischen der Anfangs- und der Endabsorptionsintensität für jede Datenreihe.
- Bestimmen Sie die Absorption in der Mitte zwischen der Anfangs- und Endabsorption für jede Serie, oder die Absorptionsmittelpunkte.
- Finde heraus, wo der Mittelpunkt auf jeder Linie liegt und identifiziere den pH-Wert an diesem Punkt. Diese pH-Werte sind die pKa's von freiem und gebundenem Neutralrot.
- Hier sehen wir einen Anstieg des pKa um etwa eins zwischen freiem und gebundenem Neutralrot, was darauf hindeutet, dass gebundenes protoniertes Neutralrot eine um eine Größenordnung schwächere Säure ist als freies protoniertes Neutralrot.