Säulenchromatographie

Säulenchromatographie

Es gibt mehrere Techniken, um Verbindungen in einem Labor für organische Chemie zu reinigen und zu trennen. Eine der zuverlässigsten Trenntechniken für mikroskalige Trennungen, bei denen weniger als 10 Gramm der Verbindung für die Analyse zur Verfügung stehen, ist die Säulenchromatographie. Diese Technik trennt Verbindungen in einem Gemisch basierend auf ihren physikalischen Eigenschaften wie Löslichkeit, Polarität, Hydrophobizität, Größe und Ladung.

Grundlagen der Chromatographie

Die Hauptkomponenten eines jeden Chromatographiesystems sind die stationäre Phase, die mobile Phase und das zu analysierende Probengemisch. Bei der Säulenchromatographie besteht die stationäre Phase typischerweise aus mikroskaligen Kügelchen, die gleichmäßig in einer vertikalen Säule verpackt sind. Ein kontinuierlicher Fluss der mobilen Phase, auch Lösungsmittel genannt, wird an der Oberseite der Säule zugesetzt, die durch die Schwerkraft oder mit einer kontrollierten Durchflussrate durch eine Pumpe durch die stationäre Phase fließt.

Die Probe wird in einer kleinen Menge des Lösungsmittels aufgelöst und dann auf die Oberseite der Säule gegeben. Mehr Lösungsmittel wird hinzugefügt, um die Probe zu zwingen, durch die stationäre Phase zu fließen. Die Verbindungen im Gemisch teilen sich aufgrund ihrer unterschiedlichen Eigenschaften zwischen der mobilen und der stationären Phase auf und bilden diskrete Banden.

Verbindungen mit starken Wechselwirkungen mit der stationären Phase bewegen sich langsamer als Verbindungen mit schwachen Wechselwirkungen mit der stationären Phase. Daher verlassen Verbindungen mit schwachen Wechselwirkungen die Säule früher oder eluieren als solche mit starken Wechselwirkungen. Die Stärke der Wechselwirkung einer Verbindung mit der stationären Phase wird durch den Verzögerungsfaktor (R_f) definiert, der das Verhältnis der von einer Komponente zurückgelegten Strecke zu der von der mobilen Phase zurückgelegten Strecke darstellt. Der Verzögerungsfaktor wird zunächst durch eine Dünnschichtchromatographie bestimmt.

Ein hoher Wert des Verzögerungsfaktors deutet darauf hin, dass die Probe stark mit der stationären Phase interagiert und lange braucht, um zu eluieren. Ein niedriger Wert des Verzögerungsfaktors deutet darauf hin, dass die Probe nicht sehr stark mit der stationären Phase wechselwirkt und schneller eluiert. Da sich Verbindungen in einzelne Banden aufteilen und aufgrund ihrer unterschiedlichen R_f-Werte zu unterschiedlichen Zeitpunkten aus der Säule eluieren, können sie einzeln isoliert werden, indem das Lösungsmittel unter der Säule in Fraktionen gesammelt wird.

Überlegungen zur Säulenchromatographie

Eine Chromatographiesäule ist ein vertikal ausgerichtetes Glas- oder Kunststoffrohr. Die Größe der Säule kann von wenigen Zentimetern (z. B. bei einer Pasteur-Pipette) bis zu Metern (z. B. bei industriellen Säulen) reichen. Der Durchmesser der Säule hängt von der Menge der zu trennenden Probe ab, während die Länge der Säule von der Schwierigkeit der Trennung abhängt. Die effizienteste Partitionierung in diskrete Bänder erfordert dünne Probenschichten; Daher ist die Bestimmung des geeigneten Durchmessers ein wichtiger Schritt. Wenn zu viel Probenvolumen relativ zum Durchmesser der Säule geladen wird, entstehen breitere und weniger definierte Banden als das gleiche Probenvolumen in einer Säule mit größerem Durchmesser.

Bei der Wahl der Spaltenlänge sind die Rf-Werte der Komponenten zu berücksichtigen. Komponenten mit ähnlichen Verzögerungsfaktoren können schwierig zu trennen sein und erfordern eine längere Säule, um die einzelnen Banden aufzulösen. Verbindungen mit sehr unterschiedlichen Verzögerungsfaktoren benötigen möglicherweise keine lange Säule, da sie sich leicht trennen sollten. Bei der Auswahl der stationären Phase ist es wichtig, eine zu wählen, die für jede Komponente unterschiedliche Verzögerungsfaktoren zur Folge hat.

Die Vorbereitung der Säule ist der wichtigste Teil beim Betrieb einer Chromatographiesäule. Die Masse der stationären Phase, die in der Säule verpackt ist, sollte mindestens das 20-fache der Masse der Probe betragen. Wenn die Säule unten keine poröse Scheibe hat, sollte sie mit Watte und einer dünnen Schicht Sand gefüllt werden. Dadurch wird verhindert, dass die stationäre Phase durch den Austritt der Säule

Es gibt zwei Methoden, um die Säule zu packen: die Trockenpackmethode und die Güllemethode. Beim Trockenverfahren wird die stationäre Phase in Pulverform in die Säule überführt. Die Säule wird dann mehrmals mit der mobilen Phase/dem Lösungsmittel gewaschen, um sicherzustellen, dass das Lösungsmittel jeden Teil der Kieselgelsäule durchdringt. Wenn diese Methode nicht richtig durchgeführt wird, kann sie die Wahrscheinlichkeit erhöhen, dass sich trockene Stellen, Kanäle und Luftblasen in der Säule bilden. Diese Defekte beeinträchtigen die Fähigkeit der Säule, Komponenten eines Gemisches zu trennen.

Die Güllemethode bietet eine gleichmäßiger gepackte Säule, die keine Luftblasen, trockenen Bereiche und Kanäle enthält. Bei diesem Verfahren wird die stationäre Phase mit einem Lösungsmittel vermischt, um eine gleichmäßige Aufschlämmung zu bilden. Die Gülle wird dann in die Säule überführt, indem an den Seiten geklopft wird, um die gebildeten Luftblasen zu entfernen. Der Absperrhahn der Säule, falls vorhanden, sollte während dieses Schritts geöffnet sein, damit das Lösungsmittel abfließen kann.

Kieselgel-Chromatographie

Viele verschiedene Eigenschaften werden genutzt, um ein Gemisch von Verbindungen zu trennen, wie z. B. Größe, Ladung und Hydrophobizität. Eine Eigenschaft, die in der organischen Chemie zur Trennung von Verbindungen verwendet wird, ist die Polarität. Hierfür sind Kieselgel und Tonerdegel die am häufigsten verwendeten stationären Phasen. Kieselgel ist extrem polar und bildet starke Dipol-Dipol-Wechselwirkungen mit polaren Verbindungen. Darüber hinaus kann Kieselgel aufgrund des Vorhandenseins von -OH-Gruppen auf seiner Oberfläche Wasserstoffbrückenbindungen mit dem Analyten bilden.

Die polarsten Bestandteile des Gemisches binden sich stark an das Kieselgel und wandern langsam durch die Säule, während unpolare Bestandteile in der mobilen Phase besser löslich sind und schnell durch die Säule wandern. Daher ist es wichtig, dass die Bestandteile des Gemisches unterschiedliche Polaritäten haben. Komponenten, die stark mit der stationären Phase wechselwirken, werden eluiert, indem eine polare mobile Phase durch die Säule fließt.

Referenzen

1. Shuler, M.L., Kargi, K., DeLisa, M. (2017). Bioverfahrenstechnik, Grundkonzepte. Upper Saddle River, NJ: Prentice Hall.
2. Harris, D.C. (2015). Quantitative chemische Analyse. New York, NY: W.H. Freeman und Company.