$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Vor Beginn der Vorbereitung:
- Wandering yhird instar Drosophila-Larven
- HL3.1 (Modified Hämolymphe-like)-Lösung
- Sylgard (transparent Silikon-Kautschuk) Dissektion Platten in kleine (35 x 10 mm) Kunststoff-Petrischalen mit Methoden von Brent und McCabe (2008) 3 beschriebenen Verfahren hergestellt.
- Cut Dissektion Stifte kurz
- Stimulationselektrode Pipetten
- Sharp Aufnahme Pipetten
HL3 Lösung:
- 70 NaCl, 5 KCl, 4 MgCl 2, 10 NaHCO 3, 5 Trehalose, 115 Saccharose und 5 HEPES, pH 7,2: Während Dissektionen und elektrophysiologischen Experimenten werden Larve in HL3.1 Lösung 2, die (in mM) enthält, eingetaucht.
- Die Konzentrationen von CaCl 2 sind die HL3.1 Lösung für die erforderliche Konzentration von extrazellulärem Ca 2 + zu addieren.
- Larven Dissektionen sind bei niedrigen Ca 2 +-Konzentrationen (die Muskelkontraktion zu vermeiden) mit HL3.1 + 0,25 mM CaCl 2, auf Eis gehalten durchgeführt.
- Elektrophysiologische Experimente sind in der Regel in HL3.1 aufgezeichnet + 1 mM CaCl 2, aber das kann von 0,4 eingestellt werden - 1 mM Ca 2 + als erforderlich.
- Die Lösung ist HL3.1 Filter vor dem Gebrauch sterilisiert und bei 4 ˚ C.
Vorbereitung der anregenden und Aufnahme Pipetten:
- Heat = 390, Filament = 4, Velocity = 35, Delay = 200 und Pull = 0:. Recording und anregende Pipetten sind mit einem Sutter P-2000 Laser basiert Mikropipette Abzieher mit den folgenden Einstellungen gezogen
- Stimulationselektroden sind aus dünnwandigen Kapillaren aus Borosilikatglas mit breiten Enden, die etwas größer als die Breite der abgetrennten Motor Axone wurden vorbereitet. Die geformten Enden firepolished zu einer glatten Oberfläche (mit einer Pipette Narashiga Polierer), um Schäden an den Nerven zu minimieren geben. Stimulationselektroden sind ausgestattet mit Bad-Lösung (HL3.1 + 1 mM Ca 2 +) gefüllt.
- Die Aufnahme Elektroden sind aus 1,2 mm Borosilikatglas, das gezogen wird, um eine scharfe Pipette (30-60 mW) zu bilden, und mit 3M KCl vorbereitet.
Teil 1: Präparation des Drosophila-Larven
- Drittens instar wandernde Larven werden seziert, um die Muskeln im Körper Wand freizulegen, wie beschrieben bisher 4.
- Dissektionen sind in HL3.1 durchgeführt + 0,25 mM Ca 2 + auf kleinen Silikon-Platten (35 x 10 mm). HL3.1 Lösung muss eiskalten für Dissektionen werden, um die Larve zu betäuben, und ist auf dem Eis vor und während der Sektionen gehalten.
- Die Larven werden seziert mit Methoden von Brent und McCabe (2008), dass für die Elektrophysiologie Experimenten durch Zugabe von 0,25 mM Ca 2 + auf die HL3.1 Dissektion Lösung, und mit kurzen Dissektion Pins (~ 2 mm in der Länge), die weniger verändert wird beschrieben wahrscheinlich das Mikroskop-Objektiv und Elektroden während eines Experiments getroffen.
- Nach Dissektion, sind der Motor Axone der Larven durchtrennt. Dies wird durch leichtes Halten des ZNS und erhöhen sie leicht, so dass die peripheren Nerven, die die Muskeln hinter dem Bauchganglion innervieren, ohne die Muskeln (Abbildung 1) geschnitten werden kann getan. Das Gehirn wird dann entfernt.
- Die seziert Larven Vorbereitung wird zweimal mit HL3.1 gewaschen + 1 mM Ca 2 +.
Abbildung 1. Schematische Darstellung der Schritte bei der Reduzierung der Motor Axone seziert Larven beteiligt. Das ZNS ist mit einer Pinzette angehoben und der Motor Axone sind an der Basis des Gehirns geschnitten.
Teil 2: Intrazelluläre Aufnahme von Larven Muskelzellen.
- Legen Sie die Dissektion Platte auf der Elektrophysiologie Mikroskop und tauchen prep mit HL3.1 + 1,5 mM Ca 2 + und fixieren Badelektrode so dass es in Kontakt mit der Lösung ist.
- Alle Experimente sind auf Muskel-6 innerhalb der dritten Abdominalsegment (A3) durchgeführt. Periphere Nerven, die die Muskeln innervieren angeregt mit einem Saug-Elektrode 5.
- Position der stimulierenden Elektrode in die Schüssel ersten Erschütterungen zu vermeiden, wenn die intrazelluläre Elektrode vorhanden ist. Setzen Sie den stimulierenden Elektrode in unmittelbarer Nähe des motorischen Neurons innervieren einen Muskel 6 und gelten sanfte Saugwirkung, bis der Schnitt Nerv im Inneren der Glaspipette. Achten Sie darauf, nicht auf die Nerven dehnen, wenn Saug angewendet wird. Heben Sie die Pipette etwas so ist es nicht berühren, die Muskel-und positionieren Sie es, damit es nicht zieht sich auf den Schnitt Nervenfasern (Abb. 2).
Abbildung 2. Eine schematische Darstellung der Muskulatur und innervieren Motoneuronen eines Abdominalsegment aus der Drosophila Larve. Die Position des anregenden Pipette und durchtrennten Nerven und die Aufnahme Elektrode in Position Muskel 6 sind dargestellt. - Intrazellulären Aufnahmen sind mit scharfen Mikroelektroden mit 3 M KCl gefüllt. Position der Aufnahme-Elektrode oberhalb des Zentrums von Muskel-6 auf dem dritten Abdominalsegment (A3) und stellen Sie die Eingangs-Offset so dass es Null für die Badlösung liest. Langsam senken die Elektrode und Ansatz des Muskels unter hohem optischen Vergrößerung, bis er den Muskel Oberfläche berührt. Sehen Sie sich das Oszilloskop, um zu bestätigen, dass der Muskel wurde durchbrochen. Das Ruhemembranpotential sollte mindestens -60 mV, oder das Tier sollte nicht verwendet werden. Sporadische Miniatur Endplatte Potenziale sollten jetzt sichtbar sein. Lassen Sie die Zelle für eine Minute, bevor die Aufnahme zu stabilisieren.
- Änderungen in Membranpotential sind mit einem Axon HS-2A Kopf Bühne und ein Axoclamp 2B Verstärker erfasst und aufgezeichnet mit CLAMPEX v 8.2.0.235 (Axon Instruments). Die Axoclamp 2B ist eine Schnittstelle mit einem Computer, pCLAMP Software und arbeitet in Verbindung mit dem Digidata 1322a-Schnittstelle läuft.
- Die Zellen wurden für 3 Minuten ohne Stimuli zu mEJP Reaktionen messen aufgezeichnet. Die Spuren wurden mit Mini-Analyse-Software (Synaptosoft, v 6.0.3) und die mEJP Amplitude und Frequenz bestimmt.
Nerve Stimulation:
- Der abgetrennte Ende des motorischen Neurons ist mit einer Reihe von quadratischen Spannungsimpulse (0,3 ms Dauer) mit einer Intensität, die ausreicht, sowohl Motor Axone, um konsistente Antworten in der gesamten Muskulatur hervorrufen wird angeregt.
- Der Reiz wird mit dem Master-8 Impulsgeber, die so programmiert werden, Impulse kontinuierlich liefern je nach Dauer und Intervall-Zeiten generiert.
- Lassen Sie fünf Sekunden zwischen Stimuli für die synaptische Erholung an der NMJ.
- Bei der Bestimmung der Stärke des Reizes, mit der untersten Ebene beginnen und die Intensität langsam über mehrere Studien. Die minimale Reizstärke, die in einem evozierte Ergebnisse sollten in Experimenten verwendet werden.
- Wenn die entsprechende Reizintensität erreicht ist, sollte es eine Verbindung EJP und eine Muskelkontraktion durch den Reiz hervorgerufen werden.
- Rekord mindestens 10 evozierte Potentiale aus jeder Muskel und der Mittelwert der Amplituden.
Teil 3: Repräsentative Ergebnisse
Abbildung 3. Representative intrazelluläre Aufnahme von Muskel-6, welche die evozierten EJP das ist Reaktion auf elektrische Stimulation der segmentalen Nerven, und die sporadischen Miniatur-Endplatten Potentialen oder mEJP ist. EJP Amplituden im Muskel 6 von gesunden Wildtyp-Larven, wie Canton S, sind in der Regel um 40 mV und die mEJP Amplituden zwischen 1-3 mV.