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Zebrafische sind seit langem verwendet, um die zellulären und molekularen Mechanismen der Entwicklung von Zeitraffer-Bildgebung des lebendigen transparent Embryo zu studieren. Hier beschreiben wir eine Methode zur Zebrafisch-Embryos für die langfristige Bildgebung montieren und zu demonstrieren, wie die Erfassung von Zeitraffer-Aufnahmen mit einem konfokalen Mikroskop zu automatisieren. Wir beschreiben eine Methode, um den kontrollierten, präzisen Schäden an einzelnen Zweigen der peripheren sensorischen Axone im Zebrafisch mit dem Schwerpunkt Kraft eines Femtosekunden-Laser auf einem Zwei-Photonen-Mikroskop montiert erstellen. Die Parameter für eine erfolgreiche Zwei-Photonen-Axotomie muss für jedes Mikroskop optimiert werden. Wir werden Zwei-Photonen-Axotomie sowohl auf custom built Zwei-Photonen-Mikroskop und einem Zeiss 510 konfokalen / Zwei-Photonen auf zwei Beispiele geben zu demonstrieren.
Zebrafisch Trigeminus sensorischen Neuronen können in einer transgenen Linie, die GFP durch ein sensorisches Neuron spezifischen Promotor 1 angetrieben visualisiert werden. Wir haben diese Zebrafisch Trigeminus-Modell angepasst, um direkt zu beobachten sensorischen Axonregeneration in lebenden Zebrafisch-Embryonen. Die Embryonen werden betäubt mit Tricaine positioniert und in einem Tropfen Agarose als sie erstarrt. Immobilisierte Embryonen werden in einem bildgebenden Kammer mit Phenylthioharnstoff (PTU) Ringers gefüllt versiegelt. Wir haben festgestellt, dass Embryonen kontinuierlich in diesen Kammern werden für 12-48 Stunden abgebildet. Ein einziger konfokalen Bild wird dann erfasst, um die gewünschte Stelle des Axotomie bestimmen. Die Region von Interesse ist auf der Zwei-Photonen-Mikroskop durch die Abbildung der sensorischen Axone bei niedrigen, nicht-schädliche Macht entfernt. Nach dem Zoomen in die gewünschte Stelle des Axotomie, wird die Leistung erhöht und einen einzigen Scan des definierten Bereichs ist ausreichend, um das Axon zu durchtrennen. Mehrere Lage Zeitraffer-Imaging wird dann auf einem konfokalen Mikroskop direkt beobachten axonalen Erholung von Verletzungen gesetzt.