Wir beschreiben, wie man in der Nähe Membran und globalen intrazellulären Calcium-Dynamik in kultivierten Astrozyten mit Totalreflexion und Epifluoreszenzmikroskopie messen.
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Methodenartikel
Messen in der Nähe Plasmamembran und Global intrazellulären Calcium-Dynamics in Astrozyten
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Das Gehirn enthält Gliazellen. Astrozyten, eine Art von Gliazellen, sind seit langem bekannt, eine passive unterstützende Rolle zu Neuronen liefern. Allerdings schlägt immer deutlicher, dass Astrozyten kann auch aktiv in die Gehirnfunktion zu beteiligen durch funktionelle Interaktionen mit Neuronen. Allerdings bleiben viele grundlegende Aspekte der Astrozyten Biologie umstritten, unklar und / oder experimentell erforscht. Ein wichtiges Thema ist die Dynamik der intrazellulären Calcium-Transienten in Astrozyten. Dies ist relevant, weil Kalzium ist auch eine wichtige second messenger gegründet und weil es wurde vorgeschlagen, dass Astrozyten Kalzium Erhebungen können die Freisetzung von Transmittern aus Astrozyten auslösen. Allerdings gibt es keine detaillierte oder befriedigende Beschreibung der in der Nähe Plasmamembran Calcium-Signalgebung in Astrozyten wurden. Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF)-Mikroskopie ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um physiologisch relevante Signalwege innerhalb von etwa 100 nm der Plasmamembran von lebenden Zellen zu analysieren. Hier verwenden wir TIRF-Mikroskopie und beschreiben, wie man in der Nähe Plasmamembran und globale intrazellulären Calcium-Dynamik fast gleichzeitig zu überwachen. Die weitere Verfeinerung und systematische Anwendung dieses Ansatzes hat das Potenzial, über die genauen Details der Astrozyten Calcium-Signalgebung zu informieren. Ein detailliertes Verständnis der Astrozyten Calcium-Dynamik kann eine Grundlage zu verstehen, wenn, wie, wann und warum Astrozyten und Neuronen durchlaufen eine Calcium-abhängigen funktionellen Interaktionen.
Protokoll
Experimentelle Verfahren
Das experimentelle Verfahren besteht aus zwei wichtigen Teilen, die in einem Schritt weise Weise beschrieben werden.
Teil 1: Vorbereiten des Hippocampus Astrozyten KULTUREN
Kurz gesagt wurden gemischt Hippocampus Astrozyten-Neuron Kulturen hergestellt unter Verwendung eines etablierten Protokoll 1,2,3. Wir optimieren das Verfahren zur gesunden kultivierten Astrozyten zu erhalten. Alle unten aufgeführten Schritte sollten in einer sterilen Umgebung wie einer Sterilbank durchgeführt werden.
Vorbereitung Deckgläser
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Diskussion
Es ist gut etabliert, dass Astrozyten intrazellulären Calcium-Erhebungen angezeigt. Diese spontan auftreten, kann durch neuronale Aktivität oder durch die Anwendung von Agonisten an Rezeptoren auf der Oberfläche 11 Astrozyten aktivieren ausgelöst werden. Eine wichtige und umstrittene Frage ist, ob Astrozyten intrazellulären Calcium-Erhebungen können die Freisetzung von Signalmolekülen, die Rezeptoren aktivieren auf Neuronen 11, 12 auslösen. Dies ist umstritten, weil es Beweise für und gegen diese Ansicht, wie in den Be.......
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Danksagungen
Diese Arbeit wurde von der Uehara Memorial Foundation of Japan (ES) sowie die Whitehall-Stiftung, dem National Institute of Neurological Disorders and Stroke und ein Stein-Oppenheimer Endowment Award (für BSK) unterstützt.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare | |
|---|---|---|---|---|
| VWR® Mikro-Deckgläser, rund, No. 1 | Werkzeug | VWR international | 48380-068 | |
| Poly-D-Lysin-Hydrobromid | Reagenz | Sigma-Aldrich | P0899 | |
| Laminin aus der Basalmembran des Engelbreth-Holm-Swarm-Mäusesarkoms | Reagenz | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| Earle’s Balanced Salt Solution (EBSS) (1X), flüssig | Reagenz | Invitrogen | 14155-063 | |
| Minimum Essential Medium (MEM) (1X), flüssig, enthält Earle’s Salze, jedoch kein L-Glutamin oder Phenolrot | Reagenz | Invitrogen | 51200-038 | |
| Penicillin-Streptomycin, flüssig | Reagenz | Invitrogen | 15140-122 | |
| Natriumpyruvat-Lösung | Reagenz | Sigma-Aldrich | S8636 | |
| HEPES-Lösung 1 M | Reagenz | Sigma-Aldrich | H0887 | |
| N-2 Supplement (100X), flüssig | Reagenz | Invitrogen | 17502-048 | |
| Pferdeserum, hitzeinaktiviert | Reagenz | Invitrogen | 26050-088 | |
| PAPASE-022 | Reagenz | Worthington Biochemical | LK003178 | |
| Neurobasal™ Medium (1X), flüssig, ohne Phenolrot | Reagenz | Invitrogen | 12348-017 | |
| B-27 Ergänzung ohne Serum (50X), flüssig | Reagenz | Invitrogen | 17504-044 | |
| L-Glutamin-200 mM (100X), flüssig | Reagenz | Invitrogen | 25030-149 | |
| Zellseiger | Werkzeug | BD Biosciences | 352350 | |
| BD Falcon Mehrloch-Platten mit flachem Boden und Deckel, steril | Werkzeug | BD Biosciences | 353046 | |
| NaCl | Reagenz | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| KCl | Reagenz | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| CaCl2 Hexahydrat | Reagenz | Sigma-Aldrich | 21108 | |
| MgCl2 Hexahydrat | Reagenz | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| HEPES, freie Säure | Reagenz | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| D-(+)-Glucose | Reagenz | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| Fluo-4, AM 1 mM Lösung in DMSO | Reagenz | Invitrogen | F-14217 | |
| Pluronic® F-127 20 %ige Lösung in DMSO | Reagenz | Invitrogen | P-3000MP | |
| Immersionsöl TYPE DF | Mikroskop | Cargill Labs | 16242 | |
| Offene Kammer für 25 mm runde Deckgläser, 100 μl Volumen | Werkzeug | Warner Instruments | 64-0362 (RC-21BDW) | |
| P-2 Plattform für Serie-20-Kammern, ohne Heizung | Werkzeug | Warner Instruments | 64-0278 (P-2) | |
| FluoSpheres Carboxylat-modifizierte Mikrokugeln, 0,1 μm, gelb-grün fluoreszierend (505/515), 2 % Feststoffe | Reagenz | Invitrogen | F8803 |
Referenzen
- Richler, E., Chaumont, S., Shigetomi, E., Sagasti, A., Khakh, B. S. An approach to image activation of transmitter-gated P2X receptors in vitro and in vivo. Nature Methods. 5, 87-93 (2008).
- Granseth, B., Odermatt, B., Royle, S. J., Lagnado, L.
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Nachdrucke und Genehmigungen
