Messung Caenorhabditis elegans Life Span auf festen Medien

Zusammenfassung

In diesem Artikel präsentieren wir ein allgemeines Protokoll zur Messung der Lebensdauer von Nematoden auf festen Medien mit UV-getötet bakterielle Lebensmittel erhalten.

Zusammenfassung

Altern ist ein degenerativer Prozess durch eine progressive Verschlechterung der zellulären Bestandteile und Organellen aufgrund der Mortalität gekennzeichnet. Der Fadenwurm

Protokoll

Teil 1: Bereiten Nematoden Nährmedien (NGM)-Platten

Dieser Abschnitt beschreibt die Herstellung der festen NGM-Platten für den Einsatz in der Lebensdauer zu experimentieren. Eine grundlegende Lebensdauer Experiment erfordert zwei Arten von Platten: Standard NGM-Platten, die keine Zusatzstoffe und Amp / FUDR Platten, die sowohl Ampicillin (Amp) und Fluordeoxyuridin (FUDR) hinzugefügt, um die NGM haben enthalten. Ampicillin wird verwendet, um ausländische bakterielle Kontamination zu vermeiden. FUDR hemmt die Zellteilung, reduziert Eierproduktion, und verhindert, dass Eier aus dem Schlüpfen. Die Verwendung von FUDR für Langlebigkeit Analyse hat keinen Einfluss auf das Erwachsenenleben Spannweite und beseitigt die Notwendigkeit, Würmer übertragen alle paar Tage, um sie von der wachsenden Larve zu trennen. Beide Arten von Platten sind mit E. ausgesät coli OP50 Bakterien, die anschließend durch Bestrahlung mit UV getötet wird.

1. Bereiten NGM (siehe Abschnitt 5 für die Rezept-und Storage-Noten) und Label-Petrischalen. Sie benötigen 1 60 mm Petrischale pro 10 ml NGM. Wenn Sie mit den zuvor hergestellten festen NGM beginnen, weiter auf 1,2 Schritt. Wenn Sie mit frisch autoklaviert NGM ab, fahren bis 1,4 Schritt.
2. Vollständig zu schmelzen solide NGM durch die Mikrowelle auf hoher in 30 Sekunden Impulse. Swirl Medien zwischen den Impulsen, um Druck Gasblasen aus dem Aufbau zu verhindern.
3. Legen Flüssigkeit NGM in 55 ° C Wasserbad oder auf der Bank, um abzukühlen.
4. Sobald NGM erreicht 55 ° C add 33 ul 150 mM FUDR und 100 ul von 100 mg / mL Ampicillin pro 100 ml NGM (für Amp / FUDR Platten) und wirbeln zu mischen. Für NGM-Platten ohne zusätzliche Medikamente gehen direkt bis 1,5 Schritt.
5. Mit einer sterilen Technik Pipette 10 mL NGM in jede 60 mm Petrischale. Vermeiden Sie Blasen bildet, wenn möglich. Wenn sich Blasen bilden, können sie tauchte mit einer Pipettenspitze werden.
6. Lassen Platten auf dem Arbeitstisch mit Deckel auf, damit NGM zu festigen und zu trocknen. Wenn möglich, die Platten auf Sitzbank für 2 Tage vor dem Hinzufügen von Bakterien, aber 1 Tag funktioniert, wenn die Platten früher benötigt werden.
7. Am Tag, bevor die Platten fertig Trocknen, Samenflüssigkeit LB-Kultur mit einer einzelnen Kolonie von einer frischen Spur von E. coli OP50 Bakterien auf LB-Agar. Sie sollten mindestens 1 mL einer Übernachtkultur OP50 Kultur pro 60 mm-Platte vorbereiten.
8. Legen Sie OP50 Kultur in 37 ° C Schüttler und lassen Bakterien wachsen über Nacht (Kultur sollte Sättigung zu erreichen).
9. Pellet OP50 Bakterien durch Spinnen bei 3.500 g für 10 Minuten.
10. Nehmen Sie 90% der Überstand und resuspendieren Bakterien zu konzentrieren Kultur 10x.
11. Je 100 ul von 10x konzentriert OP50 Kultur in den Mittelpunkt verfestigt NGM-Platten. Swirl Platten vorsichtig, um sich auszubreiten Bakterienkultur, wenn nötig (idealerweise Bakterien sollte der zentrale Bereich der NGM, ohne kommenden nahe der Platte Wände bedecken). Versuchen Sie zu vermeiden, berühren die Pipettenspitze an die Oberfläche der NGM, wie Fehler in der Oberfläche der Medien die Würmer erlauben, sich in das NGM.
12. Lassen Platten auf dem Arbeitstisch über Nacht zu ermöglichen Bakterienkultur auf der soliden NGM (dauert in der Regel etwa 24 Stunden) trocknen lassen.
13. Nach dem Trocknen aussetzen die Oberfläche der Platten mit einer UV-Dosis ausreichend, um das Wachstum der Bakterien zu verhaften. Wenn Sie einen Stratagene UV Stratalinker 2400:
    • Legen Platten in der Stratalinker und entfernen Deckel
    • Schließen Sie die Tür und schalten Sie den Stratalinker
    • Drücken Sie 'Energy'
    • Geben Sie '9999 'über die Tastatur
    • Drücken Sie 'Start'
    • Die Platten werden mit UV für ca. 5 Minuten ausgesetzt werden
14. Platten mit UV-abgetöteten Bakterien können auf den Kopf bei 4 ° C gelagert werden bis zu 1 Monat.

Teil 2: Führen Sie eine zeitgesteuerte Eiablage zu einem Alter synchronisierten Population von Tieren zu erwerben

In diesem Abschnitt erzeugen wir eine Bevölkerung von Würmern mit einem gemeinsamen Luke-date. Dies wird erreicht, indem reproduktiv aktiven Erwachsenen, Eier auf einem Teller legen für einen definierten Zeitraum und damit die Eier zu entwickeln durchgeführt.

1. (Optional) Transfer ca. 20 jungen erwachsenen Würmer eine frische NGM Platte ohne FUDR. Lassen Platten bei 25 ° C, damit Würmer zu verbreiten und durch alle bakteriellen essen. Nach der bakteriellen Lebensmittel verbraucht worden ist frisch geschlüpften Würmer treten wird das Wachstum verhaftet dauer Bühne. Sie beginnt zu dauer Larve um zu sehen innerhalb einer Woche, je nachdem, wie viele Würmer man die Platte zunächst zu übertragen. Dauer Larve kann für die nächsten Schritte für bis zu 1 Monat verwendet werden.
2. (Optional) Transfer von 20 bis 30 dauer Larve eine frische NGM Platte ohne FUDR. In Anwesenheit von Nahrung dauer Larve wird reproduktiv aktiven Erwachsenen werden innerhalb von 2 Tagen und bleiben reproduktiv aktiv für ein paar Tage danach bei 25 ° C.
3. Übertragung von 10 bis 15 reproduktiv aktiven Erwachsenen eine frische NGM Platte ohne FUDR. Diese Platte wird als zeitlich Eiablage (TEL) Platte bezeichnet.
4. Verlassen Sie die TEL Platte bei 25 ° C für 6 Stunden, um t erlaubener Würmer Zeit, um Eier zu legen.
5. Entfernen erwachsenen Würmer aus TEL Platte. Platte kann visuell für Eier vor dem Entfernen Erwachsenen kontrolliert werden. Wenn die Würmer nicht eine ausreichende Zahl der gelegten Eier haben die TEL Platte kann bei 25 ° C für bis zu einer Gesamtzahl von 24 Stunden vor dem Entfernen von erwachsenen Würmer links.
6. Ort TEL Platte bei 20 ° C, bis die Eier ausgebrütet haben und die Würmer haben die L4 Larvenstadium (dies dauert in der Regel 2 Tage für Wildtyp C. elegans, kann aber länger dauern, Stämme mit langsamen Entwicklung Phänotypen) entwickelt.

Teil 3: Ergebnis Tiere Lebensdauer

In diesem Abschnitt folgen wir dem Alter synchronisiert Bevölkerung von Würmern aus Teil 2, bis sie sterben. Worms auf Amp / FUDR Platten gehalten, um die Eiererzeugung und bakterielle Kontamination zu vermeiden und sind tot, wenn sie auf äußere Reize reagieren, nicht berücksichtigt.

1. Transfer-L4 Larve zur ausgesät Amp / FUDR Platten. Für jeden Stamm oder Bedingung getestet, ist es üblich, einrichten 2-3 Platten mit 25-30 Würmer pro Platte. Bilder von der C. elegans Lebensphasen dienen (Abbildung 1). ¹
2. Legen Amp / FUDR Platten bei 20 ° C für 24 Stunden.
3. Nach 24 Stunden visuell beurteilen Würmer, Medien und Bakterien. Transfer-Würmer an die frische Amp / FUDR Platten, wenn eine der folgenden beobachtet:
   • Worms haben die meisten der bakteriellen gegessen. Früh in der Lebensdauer Experiment Würmer müssen transferiert 1 bis 2 Mal pro Woche, um die Bakterien aus zur Neige zu verhindern.
   • Eine beträchtliche Anzahl von Larven vorhanden sind. Dies ist normalerweise ein Indiz dafür, dass die Würmer die Amp / FUDR Platten als junge Erwachsene statt L4s übertragen wurden und konnten einige Eier zu legen, bevor die FUDR in Kraft getreten. Die FUDR wird in der Regel verhindern, dass die Larven von Hineinwachsen in voller Erwachsenen, aber gelegentlich ein paar werden zu Erwachsenen wachsen und nicht zu verwechseln mit den Versuchstieren.
   • Live / Anzucht von Bakterien beobachtet werden. Im Allgemeinen wird die Kombination von Amp und UV-Tötung sicherzustellen, dass keine lebenden Bakterien das Experiment verseuchen, aber gelegentlich auftritt.
   • Pilzwachstum auf den Medien beobachtet. Bei frühem genug ist, kann das Pilzwachstum in der Regel ausgeschnitten werden mit einer Pipettenspitze oder Spachtel. Sobald es wächst, größer zu sein als ein paar Millimeter im Durchmesser ist es meist einfacher, die Würmer auf eine neue Platte übertragen.
   • Mit der Zerlegung Umfang, festzustellen, ob jeder Wurm lebt oder tot ist.
   • Klopfen Sie leicht die Platte. Der Wurm lebt, wenn es in Reaktion auf das Klopfen bewegt.
   • Wenn der Wurm reagiert nicht auf Klopfen der Platte, zoomen Sie auf den Kopfbereich.
   • Klopfen Sie leicht den Wurm den Kopf mit Platin Abholservice. Ergebnis der Wurm als tot, wenn sie nicht durch Bewegungen seines Kopfes reagiert.
   • Tote Würmer können von der Platte entfernt werden.
4. Notieren Sie den Zeitpunkt und die Anzahl der Würmer, die lebendig und tot sind.
5. Zurück Platten bis 20 ° C.
6. Wiederholen Sie die Schritte 3.3 bis 3,6 alle 2 bis 3 Tage, bis alle Würmer gestorben.

Teil 4: Repräsentative Ergebnisse.

Die Rohdaten von einem Nematoden Lebensdauer Experiment erzeugt wird, eine Liste von Terminen mit entsprechenden Anzahl von Würmern, die lebendig und tot für jeden Stamm getestet werden. Die Zahl der Würmer, die an jedem Tag sterben ist in der Regel umgekehrt, um den Anteil der Würmer lebend an jedem Tag (Abbildung 2A), die graphisch als Überlebensstrategie Kurve (Abbildung 2B dargestellt berechnen, der Tag der zeitlich Eiablage wird als Tag 0 ). Die Lebensdauer für jeden einzelnen Wurm in der Studie kann von der Anzahl der Würmer, die an jedem Tag sterben berechnet und verwendet werden, um mittlere und mittlere Lebensdauer für den Vergleich zwischen den Stämmen zu berechnen. Die Anzahl der Anzahl der Würmer lebend an jedem Tag wird nicht direkt in Lebensdauer-Analyse verwendet. Worms auf festen Medien gepflegt wird gelegentlich "fliehen", oder kriechen entweder an der Wand der Platte oder sich unter den Medien. Die Zahl der Würmer lebend an jedem Tag können Sie bestimmen, wie viele Würmer flohen im Laufe des Experiments werden. Worms, die fliehen, sind in der Regel aus der Analyse entfernt. Als Orientierungsgröße gilt, die typische mittlere Lebensdauer für N2, die C. elegans Wildtypstamm, auf UV-abgetöteten Bakterien bei 20 ° C gehalten wird ca. 25 Tage vom Ei gemessen.

Teil 5: Lösungen

Nematode Growth Media (NGM), 100 ml:
Kombinieren Sie:
0,3 g	NaCl
0,25 g	Pepton
2 g	Agar
Autoklaven für 40 Minuten abkühlen lassen und auf 55 ° C, dann hinzuzufügen:
100 ul	1 M MgSO 4
100 ul	5 mg / ml Cholesterin
100 ul	1 M CaCl2
1,625 mL	1,5 M KPi pH 6,0
Flüssige NGM kann sofort verwendet werden, um Platten gießen oder erstarren gelassen und langfristig aufbewahrt bei Raumtemperatur

Luria Broth (LB), 1L:
10 g	BactoTryptone
5 g	Hefeextrakt
10 g	NaCl
10 mL	1 M Tris pH 8,0
1 L	VE-Wasser
Autoklaven und bei Raumtemperatur lagern.

1 M MgSO 4, 300 ml:
73,95 g	MgSO 4
300 mL	VE-Wasser
Autoklaven und bei Raumtemperatur lagern.

5 mg / ml Cholesterin, 200 ml:
1 g	Cholesterin
200 mL	100% Ethanol
Filter sterilisiert und bei Raumtemperatur lagern.

1 M CaCl 2, 500 mL:
27.75 g	CaCl 2
500 mL	VE-Wasser
Filter sterilisiert und bei Raumtemperatur lagern.

1,5 M KPi pH 6,0, 1L:
Kombinieren Sie:
31,4 g	KPi zweibasische
179,6 g	KPi einbasischen
850 ml	VE-Wasser
Hitze beim Mischen zu ermöglichen KPi in Lösung aufzulösen. Der pH-Wert auf 6,0 mit 10 N NaOH.
Add entionisiertem Wasser auf 1 L.
Autoklaven und bei Raumtemperatur lagern.

1 M Tris, pH 8,0:
60,57 g	Tris
400 mL	VE-Wasser
Der pH-Wert auf 8,0 mit HCl.
Add entionisiertem Wasser auf 500 mL.
Filter sterilisiert und bei Raumtemperatur lagern.

150 mM Fluordeoxyuridin (FUDR), 10 mL:
0,3693 g	FUDR
10 mL	sterilem, deionisiertem Wasser
Lagerung bei -20 ° C.

100 mg / mL Ampicillin (Amp), 10 mL:
1 g	Ampicillin
10 mL	sterilem, deionisiertem Wasser
Lagerung bei -20 ° C.

50 mg / mL Carbenicillin (CARB), 10 mL:
500 mg	Carbenicillin
10 mL	sterilem, deionisiertem Wasser
Lagerung bei -20 ° C.

1 M Isopropyl β-D-thiogalactopyranosid (IPTG), 10 mL:
2,38 g	IPTG
10 mL	sterilem, deionisiertem Wasser
Lagerung bei -20 ° C.

Abbildung 1. Hellfeld Bilder von C. elegans Lebensstadien, einschließlich der Eier, die vier Larvenstadien (L1 - L4) und Erwachsenen. Alle Tafeln zeigen Hermaphroditen mit Ausnahme der unteren rechten, die einem erwachsenen Mann (Image von Holz (1988)) zeigt.

Abbildung 2. Repräsentative Ergebnisse aus einer C. elegans Lebensdauer Experiment verglichen Wildtypstamm N2 zu einem Stamm, einer Mutation in der daf-2-Gen. (A) Eine Tabelle mit den gesammelten Daten, einschließlich der Anzahl der Tage seit Würmer wurden Eier, die Anzahl der toten Würmer auf jeden Tag beobachtet, und der Prozentsatz der ursprünglichen Probe noch auf jeden Tag lebendig (wie aus der täglichen Grafen von toten Würmer berechnet) . (B) Überlebenskurven entsprechend der Lebensdauer von Daten in (A) zur Verfügung gestellt.

Abbildung 3. Representative Vergleich von Lipofuszin zwischen jungen und alten Erwachsenen C. elegans. Hellfeld Bilder sind auf der linken und DAPI Kanal Fluoreszenz-Aufnahmen auf der rechten Seite angezeigt. Top Tafeln zeigen eine 4 Tage alte Wurm und Bodenplatten zeigen eine 11 Tage alten Wurm (wie vom Ei gemessen).

Diskussion

Die genetische Kontrolle der Langlebigkeit wurde ausgiebig in C. studierte elegans, vor allem wegen der Leichtigkeit und Schnelligkeit, mit der Lebensdauer bestimmt werden kann. Das Protokoll in diesem Artikel beschrieben wird ein Grundgerüst für den Erhalt von reproduzierbaren Lebensdauer von Daten in C. elegans und kann auch auf relatednematode Arten angewendet werden. ² Durch ein paar einfache Änderungen dieser Verfahren angepasst Lebensdauer unter verschiedenen Bedingungen gemes...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Agar	Reagenz	Fisher Scientific	DF0145-17-0 (214530)
Ampicillin	Reagenz	MidSci	0339
BactoTrypton	Reagenz	Fisher Scientific	DF0123-17-3 (211705)
BactoPeptone	Reagenz	Fisher Scientific	DF0118-17-0 (211677)
CaCl2	Reagenz	Fisher Scientific	NC9699248 (1332–01)
Carbenicillin	Reagenz	Goldbiotechnologie	C0109
Cholesterin	Reagenz	Sigma-Aldrich	C75209
Fluorodoxyuridin (FUDR)	Reagenz	Sigma-Aldrich	F0503
Isopropyl β-d-Thiogalactopyranosid (IPTG)	Reagenz	Goldbiotechnologie	I2481C5
KPi Dibasic	Reagenz	Fisher Scientific	5087862 (3252-01)
KPi Monobasic	Reagenz	Fisher Scientific	5087861 (3246-01)
MgSO4	Reagenz	Fisher Scientific	NC9561800 (2500-01)
NaCl	Reagenz	Fisher Scientific	S251
Tris	Reagenz	Sigma-Aldrich	T1503
Hefeextrakt	Reagenz	Fisher Scientific	DF0886-17-0 (288620)