Die Herstellung Drosophila Embryonen für Live-Imaging mit dem Hanging-Drop-Protokoll

Zusammenfassung

Eine einfache, kostengünstige und effektive Methode zur Herstellung von Drosophila-Embryonen für die Live-imaging-Analyse vorgestellt. Unser Protokoll sieht vor Feuchtigkeit und Gasaustausch und komprimiert nicht die Drosophila-Embryo. Diese Methode eignet sich für GFP-basierte Live-Darstellung von Drosophila-Embryonen mit einem Stereomikroskop oder aufrecht zusammengesetzte Mikroskop.

Zusammenfassung

Das grün fluoreszierende Protein (GFP)-basierte Zeitraffer Live-imaging ist eine leistungsstarke Technik für die Untersuchung der genetischen Regulation von dynamischen Prozessen wie Gewebemorphogenese, Zell-Zell-Adhäsion oder Zelltod. Drosophila-Embryos, die GFP sind leicht abgebildet entweder mit stereoskopischen oder konfokalen Mikroskopie. Ein Ziel eines jeden Live-imaging-Protokoll ist es, schädliche Auswirkungen wie Dehydratation und Hypoxie zu minimieren. Vorherige Protokolle für die Vorbereitung Drosophila-Embryonen für die Live-imaging-Analyse beteiligt Platzierung dechorionated Embryonen in Halocarbonöl und sandwiching sie zwischen einem Halogenkohlenwasserstoff gasdurchlässige Membran und einem Deckglas

Protokoll

Vorbereitung

1. Sammeln Embryonen auf Standard Traubensaft Agar Platten ^4. Es ist zweckmäßig, eine automatisierte Drosophila Egg Collector (flymax Scientific Equipment Ltd) zu verwenden. Verwenden von synchronen inszeniert Embryo Sammlungen wird die Zahl der dechorionations, die durchgeführt werden, um eine ausreichende Anzahl von Embryonen in der gewünschten Entwicklungsstadium zu erhalten muss zu reduzieren.
2. Bereiten Sie eine dechorionation gleiten durch die Anbringung eines Stück doppelseitigem Klebeband auf einen Objektträger, ziehen Sie die Schutzfolie vom Band.
3. Bereiten Sie die Live-Imaging-Kammer, indem ein Stück des Gewe....

Diskussion

Wir beschreiben eine neue Methode zur Herstellung von Drosophila-Embryonen für die Live-Imaging-Analyse, die wir als die hängenden Tropfen Protokoll. Leider ist es nicht möglich, den hängenden Tropfen-Protokoll verwenden, wenn die Arbeit mit einem inversen Mikroskop. In diesem Fall wird die Sandwich-Technik (wie in der abstrakten oben beschrieben) verwendet werden muss und Kompression der Embryonen weiterhin Anlass zur Sorge.

In Experimenten, bei denen Zellen Form und Größe gemessen, um geme.......

Materialien

Standard-Ausrüstung und Materialien benötigt, um Embryonen für Live-Imaging-Vorbereitung mit dem hängenden Tropfen Protokoll umfassen die folgenden Punkte: Objektträger, Deckgläser (22 x 40 mm, Nr. 2), doppelseitiges Klebeband, Juwelier Pinzetten (Dumont Stil Nr. 5 ), Halocarbonöl Serie 56 und Serie 700 (Halocarbon Products Corp), einem Messer oder einzelne Rasierklinge, Seidenpapier, Schere, destilliertes Wasser, Allzweck-Klebeband und einer Pipette geeignet zur Förderung von 20-40 ul. Die Live-Imaging-Protokoll erfordert auch eine maßgeschneiderte Live-Imaging-Kammer. Dies wird durch das Schneiden eines 5 mm denke Polycarbonat Kunststoffplatten an die Dimensionen eines Standard-Objektträger (75 x 25 mm) und mit einem Rotor zu einem 3mm tiefe Depression in der Folie (20 X 55 mm) erstellen vorbereitet. Der Zugang zu einem Stereomikroskop (Binokular) und eine faseroptische Lichtquelle ist ebenfalls erforderlich.