Zebrafisch Whole Mount High-Resolution Doppel Fluorescent In-situ Hybridisierung

Zusammenfassung

Whole mount in situ Hybridisierung ist eine der am häufigsten verwendeten Techniken in der Entwicklungsbiologie. Hier präsentieren wir ein hochauflösendes Doppel-Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung Protokoll zur Analyse der genauen Expressionsmuster eines einzelnen Gens und zur Bestimmung der Überlappung der Ausdruck Domains von zwei Genen. Wir gehören eine Propidiumiodid nukleare Gegenfärbung des Gewebes Organisation hervorzuheben.

Zusammenfassung

Whole mount

Protokoll

1. FIXATION

1. Fix Embryonen über Nacht bei 4 ° C mit 4% Paraformaldehyd (PFA) in PBS.
2. Entfernen Sie fix und waschen 2 x PBS, jeweils 5 Minuten bei Raumtemperatur (RT).
3. Manuelles dechorionate Embryonen in PBS in einem Glas Depression Platte mit Uhrmacher Pinzette. Nach dechorionation sind Embryonen mit einem Feuer-poliertem Glas Pasteur Pipette, wie sie Polypropylen Pipette kann bleiben.
4. -Embryonen durch eine Reihe von 25%, 50% und 75% Methanol in PBS für jeweils 5 Minuten.
5. Ersetzen Flüssigkeit mit 100% Methanol, inkubieren 5 Minuten und ersetzen Sie dann mit frischem Methanol.
6. Legen Embryonen bei -20 ° C für ....

Diskussion

Das Protokoll hier vorgestellten Arbeiten gut mit Sonden, die eine saubere starkes Signal nach Färbung für 30-45 Minuten in einem typischen alkalischen Phosphatase-vermittelte Reaktion zu geben. Vor Durchführung der Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung Protokoll haben wir immer prüfen unsere Sonden mit dem Standard nicht-fluoreszierenden Protokoll (sofern in ergänzendes Material zusammen mit der Sonde Synthese-Protokoll). Wir haben weniger Erfolg mit der Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung Protokoll hatte bei der Verwendun.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Lösung von Paraformaldehyd 16 %, EM-Reinheit	Electron Microscopy Sciences	15710	Mit 1,33× PBS auf 4 % verdünnen (endgültig 1×). In Aliquots zu je 2 ml bei –20°C lagern
Proteinase K, rekombinant, PCR-Reinheit	Roche Group	03115879001	Eine Stammlösung mit 20 mg/ml in Wasser herstellen. In Aliquots zu je 1 ml bei –20°C lagern
Blockier-Reagenz	Roche Group	11096176001	Eine 10%ige Stammlösung in 1× Maleinsäurepuffer herstellen. In Aliquots zu je 50 ml bei –20°C lagern. Mehrfaches Einfrieren und Auftauen möglich.
Anti-Fluorescein-POD, Fab-Fragmente	Roche Group	11426346910	In Aliquots portionieren und bei –20°C lagern. Ein Arbeitsaliquot bei 4°C aufbewahren.
Anti-Digoxigenin-POD, Fab-Fragmente	Roche Group	11207739910	Wie oben.
TSA Plus Fluorescein-System	PerkinElmer, Inc.	NEL741001KT	Jede Ampulle mit TSA-Reagenz erst bei Bedarf vorbereiten. In 60μl DMSO auflösen. Bei 4°C lagern.
TSA Plus Cyanine5-System	PerkinElmer, Inc.	NEL745001KT	Wie oben
TSA Plus Cyanine3-System	PerkinElmer, Inc.	NEL744001KT	Wie oben
TSA Kit #16 AlexaFluor647-Tyramid (inklusive HRP-Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG)	Molecular Probes, Life Technologies	T20926	Tyramid-Reagenz in 150μl DMSO auflösen, portionieren und bei –20°C lagern.
RNase, DNase-frei	Roche Group	11119915001	Als Lösung mit 500μg/ml bereitgestellt
Propidiumiodid	Molecular Probes, Life Technologies	P-3566	Als 1-mg/ml-Lösung in Wasser bereitgestellt.