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growth factor-coated bead platzierung auf dorsal vorderhirnneuronen explantate

Growth Factor-Coated Bead Placement on Dorsal Forebrain Explants

Dieses Video zeigt zwei Methoden für die Erstellung und Platzierung Perlen, die mit Wachstumsfaktor beschichtet wurden, auf Explantate der Entwicklungsländer Großhirnrinde. Diese Perlen können verwendet werden, um räumlich begrenzte Genexpression auf die Entwicklung von neuronalen Gewebe wie Vorderhirn Explantate induzieren. Es werden Methoden für die Verwendung sowohl Affi-Gel Perlen und Heparin Acryl Perlen gegeben.

Growth Factor-Coated Bead Platzierung auf Dorsal Vorderhirnneuronen Explantate

Das sind also die ersten Perlen, die ich verwenden werde. Es handelt sich um die blauen Gel-Perlen. Sie sind weich.Ich muss also am Ende einer Mundpipette eine gebündelte Glaspipette verwenden, um diese Kügelchen auf die mit X markierten Stellen zu bringen. Die zweite Art von Kügelchen, die ich demonstrieren werde, sind Heparin-Acryl-Kügelchen. Es handelt sich um eine steife Art von Kügelchen, und ich werde diese mithilfe einer Wolframnadel auf X-Explantate aufbringen. Dies sind die Glaskapillarrohre, die ich zunächst mit dem Bunsenbrenner schmelzen werde.Dann ziehe ich sie, um eine feinere Spitze zu erzeugen. Ich halte die Kapillare in der Mitte der Flamme und rolle sie, während das Rohr schmilzt. Ich spüre, wie es weich wird.Ich werde sie aus der Flamme heben und dann ziehen. Ich werde mit diesem Diamantschreiber eine Linie über das Kapillarrohr ritzen, um einen sauberen geraden Schnitt zu erhalten. Anschließend werde ich die Enden mit der Flamme polieren, um sie sauber zu machen.Ich werde das Kapillarrohr durch die Flamme führen, um das Ende abzurunden und die Öffnung zu verkleinern, damit es eine Perle aufnehmen kann, anstatt dass die Perle durch die Kapillare hindurchgeht. Wichtig ist, dass man das Kapillarrohr nicht allzu lange in der Flamme hält. Es handelt sich tatsächlich um einen sehr kurzen Durchgang, da es sich sonst verschließt.Ich stelle normalerweise mehrere davon her, da bei vielen die Spitze durch die Flamme versiegelt wird. Das ist schwer zu kontrollieren, daher fertigt man einfach mehrere an. Dies ist ein Beispiel für eine, bei der die Spitze versiegelt wurde.Dies ist ein Beispiel für eine gute Pipette. Ich habe 250 Mikroliter der Agel-Perlen in dieses Einor-Röhrchen pipettiert und werde sie fünfmal mit je einem Milliliter PBS waschen, um die Azilösung zu entfernen, in der sie gelagert wurden. Ich werde etwa drei Minuten warten, bis sich die Perlen abgesetzt haben, dann das überschüssige PBS abpipettieren und diesen Vorgang noch viermal wiederholen.Die Kügelchen haben sich noch nicht vollständig abgesetzt, daher lasse ich sie nun absinken und werde das überschüssige PBS abpipettieren und diesen Schritt viermal wiederholen. Am Ende werde ich 300 Mikroliter PBS hinzufügen und mit der Arbeit an den Kügelchen beginnen. Dies ist eine Standard-Mundpipette, und ich werde die von mir gezogene Kapillare nehmen und sie etwa ein Drittel des Weges hineinschieben.Füllen Sie zuerst die Pipetten mit PBS. Dies geschieht üblicherweise allein durch Kapillarwirkung. Dies ist der Deckel einer 30-Millimeter-Kulturschale, und ich habe einen Tropfen mit blauen Kügelchen hineingegeben.Daneben befindet sich ein kleiner Tropfen PBS. In dieser Schale hier liegen fünf Mikroliter Proteinpufferlösung. In diesem Fall handelt es sich um B und P vier, aber Sie können mithilfe der Mundpipette ein Protein Ihrer Wahl verwenden.Ich werde eine Perle aus diesem blauen Kreis hier entnehmen, sie einmal in dem Tröpfchen PBS spülen. Anschließend werde ich die Perle mit der Mundpipette aufnehmen und in das Tröpfchen Proteinsolution geben, um sie entweder etwa eine Stunde bei Raumtemperatur oder mehrere Stunden bei vier Grad inkubieren zu lassen. Hier sehen Sie einen Pool von Perlen in PBS, aus dem ich Perlen der richtigen Größe auswählen muss.Wenn sie zu klein sind, passieren sie einfach die Mundpipette. Sie müssen genau am Ende sitzen. Wie Sie jetzt sehen, habe ich dort einige Perlen ausgewählt, drei größere und drei kleinere Perlen.Ich werde die größeren Kügelchen im Experiment verwenden. Nun werde ich vorsichtig ein großes Kügelchen aus dem Tropfen PBS in den Tropfen Proteinsolution umsetzen. Dazu ziehe ich meine Zunge sanft vom Mundpipettierer zurück.Es handelt sich nicht um eine saugende Bewegung, sondern lediglich um die Anwendung eines geringen Unterdrucks. Anschließend werde ich es umsetzen und dann im Wesentlichen meine Zunge wieder über die Mundöffnung legen. Rohrkopf, nicht blasen, sondern lediglich etwas Überdruck erzeugen, um das Beat vom Ende abzulösen.Ich habe jetzt fünf Kügelchen im Proteinpuffer-Tröpfchen und werde sie mehrere Stunden bei vier Grad inkubieren lassen oder alternativ eine halbe bis eine Stunde bei Raumtemperatur. Dies ist die Kulturschale, die die Membran enthält, die im Medium schwimmt, zusammen mit den Auberginen, die ich bereits präpariert habe. Ich werde die Spitze meiner Pipette nehmen und etwas von dem Medium aufsaugen.Ich werde die Kügelchen unmittelbar vor dem Platzieren des Kügelchens auf dem X-Explan einmalig mit einem Tropfen Medium spülen. Dies sind die Wolframenadeln, die ich verwenden werde, um die Acrylkügelchen aufzunehmen und zu positionieren. Dies ist die Wolframenadel, und sie befindet sich jetzt in ihrer Halterung.Und das sind einige feine Pinzetten. In einem Winkel von 45 Grad. Ich werde meine Wolframnadel in der Pinzette verwenden, um eine Perle aus diesem Puffer (PBS) anzuheben und die Perle anschließend auf einen Tropfen Proteinslösung zu übertragen.Wie bereits bei den Agel-Kügelchen habe ich auch diese Acryl-Kügelchen fünfmal in PBS gespült und einen Tropfen auf diese Platte übertragen. Anschließend werde ich mit meiner Wolframnadel in einer Pinzette ein Kügelchen in einen Tropfen Protein überführen und genauso wie bei den Gel-Kügelchen inkubieren.Es handelt sich also um das Anheben einer Perle. Ich stütze meine rechte Hand fest auf den Tisch und benutze meinen linken Zeigefinger, um die Nadel zu stabilisieren, während ich in die Flüssigkeit eintauche. Ich berühre vorsichtig eine Perle mit der Nadel und hebe sie langsam aus der Flüssigkeit heraus. Manchmal fällt sie von der Nadel ab, dann nehmen Sie einfach eine weitere. Jetzt halte ich mit meiner linken Hand die 45-Grad-Kräfte. Mit den Spitzen nach unten berühre ich die Perle und die Nadel mit der Flüssigkeit und verwende sie. Benutzen Sie die Spitze der Kräfte, um sie sanft abzudrücken.Jetzt habe ich also fünf Perlen mit Protein. Gut, mit meiner rechten Hand halte ich die Wolframenadel in der Perle, und mit meiner linken Hand nehme ich die Pinzette, wieder mit der Spitze nach unten, genauso, wie ich sie von der Vier abgeschoben habe. Ich werde es hier noch einmal am x-Explan durchführen. Inkubieren bei 37 Grad, wobei die Zeit von dem jeweiligen Assay abhängt.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

University of California, Irvine (UCI).  Dieses Video zeigt zwei Methoden für die Erstellung und Platzierung Perlen, die mit Wachstumsfaktor beschichtet wurden, auf Explantate der Entwicklungsländer Großhirnrinde. Diese Perlen können verwendet werden, um räumlich begrenzte Genexpression auf die Entwicklung von neuronalen Gewebe wie Vorderhirn Explantate induzieren. Es werden Methoden für die Verwendung sowohl Affi-Gel Perlen und Heparin Acryl Perlen gegeben.

Growth Factor-Coated Bead Platzierung auf Dorsal Vorderhirnneuronen Explantate

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