Summary
Nous présentons une procédure pour former un poly (éthylène glycol) monocouche auto-assemblées (PEG-SAM) sur un substrat de silicium avec des microélectrodes d'or. Le PEG-SAM est formé en une seule étape et prévient l'encrassement biologique sur des surfaces de silicium et de l'or. L'électrophorèse est ensuite utilisé pour des biomolécules patterning jusqu'à l'échelle nanométrique.
Abstract
Nous présentons une procédure pour former un poly (éthylène glycol) (PEG) triméthoxysilane monocouche auto-assemblées (SAM) sur un substrat de silicium avec des microélectrodes d'or. Le PEG-SAM est formé dans une étape d'assemblage simple et évite l'encrassement biologique sur des surfaces de silicium et de l'or. Le SAM est utilisé pour microélectrodes robe à motifs à la norme, positive-ton lithographie. Utilisation de la microtubules comme un exemple, nous appliquons une tension continue de provoquer la migration électrophorétique à l'électrode de SAM enduit de manière réversible. Une chambre d'écoulement est utilisé pour l'imagerie de la migration électrophorétique et de structuration des microtubules
Protocol
Préparation des réactifs
Préparer un tampon PIPES (80 mM PIPES, 1 mM de MgCl2, 1 mM EGTA, ajusté à pH 6,8 avec KOH). Aliquoter et glucose oxydase magasin, la catalase et de glucose à -70 ° C et le taxol à -20 ° C selon les protocoles existants. Aliquoter et 1,2 tubuline conserver à -70 ° C selon les instructions fournies par le fournisseur.
Motif microélectrodes Au utilisant la lithographie
- Couper des tranches de silicium de 1 cm '1,5 cm en utilisant des substrats un scribe ou un cutter plaquette. Nettoyer les substrats en les plaçant dans un bécher avec de l'acétone suffisante pour les couvrir et soniquer pendant 5 minutes. Sans laisser sécher les substrats, les rincer dans de l'acétone fraîche, puis rincer immédiatement dans de l'azote à l'aide d'isopropanol et sec.
- Fabriquer microélectrodes Au sur les substrats propre en utilisant la norme, positive-ton photolithographie ou lithographie par faisceau d'électrons, en fonction de la taille des fonctionnalités souhaitées. 3 Lors de la conception de la géométrie modèle, garder le diamètre de chaque motif d'électrode en dessous de 100 microns afin d'assurer la couverture par les PEG SAM (décrits dans la section suivante). Inclure des plots de contact (~ 300 mm 2) positionnée 300 à 500 mm du modèle avec une ligne de 1 mm reliant le pad avec l'électrode (fig. 1). Placez les motifs lithographiques près du milieu du substrat pour permettre à l'espace autour du modèle pour l'assemblage de la chambre d'écoulement.
Figure 1. Géométrie de l'échantillon. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version agrandie de la figure 1. - Après le développement du motif dans la couche résister, rayer une ligne dans la résistance de la plage de contact sur le bord du substrat en utilisant une pince à épiler (Fig. 1). Dès le dépôt de métal, le scratch va permettre le contact électrique entre l'électrode et le bord du substrat. Une chambre de dépôt, de préférence avec deux sources, est utilisé pour déposer la couche de métal. Les électrodes sont formées par des dépôts de 2 nm de Cr (pour adhésion) suivie de 6 nm d'Au, sans casser le vide. Une microbalance à quartz équipée intérieur de la chambre peut être utilisée pour mesurer l'épaisseur des films lors du dépôt.
Préparer le SAM
- Préchauffer le four et dans un endroit bien aéré à 75 ° C. Préparer la solution de silanisation en ajoutant 20 ml de toluène dans un bécher de verre de 250 ml. Puis ajoutez 1 ml de PEG-silane (soit 5% v / v) pour le toluène à l'aide d'une pipette en plastique. Mélanger dans le PEG-silane bien par aspiration et une baisse de 5 à 10 fois et ensuite en remuant avec la pipette pendant 30 secondes.
- Placer les échantillons à motifs dans le bécher avec le côté à motifs vers le haut, en s'assurant qu'ils sont complètement immergés dans la solution de PEG-silane toluène et sont espacés uniformément sur tout le fond du bécher. Placer le bécher dans le four et faire cuire 18 à 21 heures à 75 ° C. Alors que le SAM est en forme, de préparer la contre (voir ci-dessous) et monter les composants supplémentaires requis pour les étapes restantes.
- Après 18 à 21 heures dans le four, le toluène doit s'évaporer en laissant les échantillons motifs dans une visqueuse de PEG-silane résidus. Ajouter 20 ml de toluène dans le bécher et laisser tremper les échantillons pendant 1-2 minutes. Retirer les échantillons du bécher et rincer avec du toluène, puis l'isopropanol, et enfin sèche à l'azote. A ce point, les échantillons doivent look propre et la couche SAM devrait être invisible à l'œil nu. SAM préparés de cette façon sont utilisables pour jusqu'à deux jours lorsqu'il est entreposé dans des conditions sèches fraîches (25 ° C, humidité modérée). Échec des résultats de formation SAM dans un revêtement de résidus teintes nuageuses ou inégale à la surface.
Fabriquer la contre-
Dans la configuration même chambre de dépôt utilisé pour le dépôt de microélectrodes, faire une contre en déposant 1 nm de Cr, suivie de 4 nm de Au sur un 22 x 50 mm n ° 1 ou n ° lamelle de verre 0. La contre-devrait être presque transparent avec une légère teinte grise ou rose. Magasin de la contre-couché côte dans une boîte de Pétri pour le garder propre.
Tubuline polymérise dans MTS
- Décongelez sans étiquette de la tubuline et la tubuline rhodamine et immédiatement se combinent à un ratio de 1:2 étiquetés sans étiquette pour obtenir brillante MTs. Mélanger à la pipette et à plusieurs reprises. Polymérisent la tubuline pendant 20-40 minutes dans un bain d'eau chauffée à 37 ° C. La longueur de la SMT sera plus grande pour les temps de polymérisation plus long. Alors que la polymérisation de la tubuline est, préparer un tampon PIPES-taxol en ajoutant le taxol à 20 mm dans un tube à centrifuger contenant un tampon PIPES. Mélanger le taxol bien par aspiration et refoulement à plusieurs reprises et vortex, puis placer le tube dans le bain chauffé à 37 ° C. Après polymérisation, diluer le SCM en 1 / 100 dans chaude TUBES-taxol tampon et le bouclierde la lumière. MT préparés de cette façon seront allongés au fil du temps et du faisceau, qui peut être réduite par une dilution supplémentaire.
- Préparer un mélange d'oxygène 10x balayage (OS) en combinant 30 ml de tampon PIPES froide (0-4 ° C), 5 ml de 50% de 2-mercaptoéthanol, 5 glucose oxydase ml, 5 ml de catalase, et 5 ml de glucose à 2. Le glucose devrait être ajouté en dernier. Mélanger par aspiration et refoulement 3-5 fois après l'ajout de chaque composant. Placer le mélange sur la glace OS, il restera en vigueur pendant environ 2 heures.
- Vérifiez que la polymérisation MT a été un succès et que les MTS sont stables sous plusieurs minutes d'excitation de fluorescence par l'imagerie de la MT préparés avec 1x OS mix. Pour l'imagerie des MTs préparés de cette façon, veillez à utiliser une combinaison d'excitation / émission filtre approprié pour la fluorescence rhodamine. Déterminer la dilution mieux travailler pour les filaments individuels d'imagerie en poursuivant la dilution de la SCM en 1 / 10-1 / 100 en utilisant un tampon PIPES et l'imagerie avec 1x OS mix.
- Préparer une chambre d'écoulement en sandwich une lamelle de verre de grande taille (22 x 50 mm) et petites (22 x 22 mm) avec deux morceaux de scotch double-face placé 2-3 mm d'intervalle. La bande est facilement coupé en lanières en le plaçant sur une lame de verre et la coupe avec une lame de rasoir. Présentez quelques microlitres de MTS dans la cellule de flux en utilisant une micropipette. Pour l'imagerie à fort grossissement, les objectifs à longue distance de travail peuvent être nécessaires pour l'imagerie de la surface supérieure de la chambre de flux. La distance de la surface de la lamelle / échantillon à la surface supérieure de la chambre d'écoulement est déterminée par l'épaisseur de la bande et devrait être de 60 à 100 mm.
Motif MTS à l'aide d'électrophorèse
- Préparer une chambre d'électrophorèse en plaçant deux fines bandes de scotch double-face à travers l'échantillon à motifs, SAM-revêtement tels que l'électrode est entre les bandes avec le chemin reliant perpendiculaire à la bande (Fig. 2). Placer la contre sur la bande double-face avec le côté métallique de toucher la bande de telle sorte que le bord de la surplombe l'échantillon de la contre-d'environ 3 mm (Fig. 2). Coupez plusieurs longueurs de 15 cm de fil de cuivre isolé aimant et la bande de 1 cm de l'isolation hors des deux extrémités. Attacher un fil à la zone exposée au pair du substrat en utilisant une petite goutte de peinture argentée tout en prenant soin d'éviter de faire un contact électrique avec la contre-(ceci peut être vérifié avec un multimètre). Fixez un second fil à la contre avec de la peinture argentée. Fils attachés avec de la peinture d'argent peut être encore fixé sur les échantillons avec du ruban adhésif.
Figure 2. Ensemble de la cellule de débit pour un microscope inversé à fluorescence. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version agrandie de la figure 2. - Présentez-MT à la dilution désirée en utilisant un tampon PIPES combinée avec l'OS à 1x concentration finale. Image à un grossissement de 20x et de localiser le motif sur la plaquette de silicium avant d'appliquer une tension. Optionnellement, la chambre de circulation peuvent être scellés à l'aide de vernis à ongles pour empêcher l'écoulement du fluide et la migration MT dans le plan de la chambre d'écoulement.
- Appliquer une tension de 1 V et observer la migration de MTS. Basse tension (jusqu'à environ 0,5 V) peut être utilisé si le piégeage réversible de MTS est souhaitée, mais cela nécessite d'étanchéité de la chambre d'écoulement pour éviter la dérive latérale. Vernis à ongles fonctionne bien pour sceller les extrémités ouvertes de la chambre d'écoulement. Des tensions supérieures à environ 0,7 V, une certaine adhérence MT peut être vu sur le schéma, mais il sera faible. Des tensions supérieures à environ 0,9 V, la migration MT sera plus rapide, et l'adhésion sera plus forte. Au-dessus de 1,2 V la probabilité pour l'électrolyse induisant (formation de bulles de gaz) et aussi pour détruire les micro-électrodes augmente considérablement. La migration peut être suivi en ajustant le plan vertical du foyer du microscope. Si elle est effectuée correctement, le MTS de localiser à la surface des électrodes.
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Discussion
La migration des MTS est facilement visualisée en utilisant la microscopie à fluorescence en raison de leur luminosité et la fluorescence de fond faible. La méthode est généralement applicable à la structuration de biomolécules, comme il exige seulement que les biomolécules être amené à porter une charge nette par un ajustement approprié du pH tampon. L'électro-osmose est évitée dans cette configuration, car il n'ya pas de surfaces chargées tels que les murs de la silice utilisée en électrophorèse capillaire.
Plusieurs modifications de cette méthode sont possibles. Etanchéité des extrémités de la chambre d'écoulement est critique pour observer la réversibilité car l'évaporation à partir des extrémités ouvertes provoque un écoulement de liquide en vrac et de la migration MT indésirables. L'oxydation de la plaquette de silicium avant patterning lithographie permettra d'éviter la conduction à travers le substrat, permettant de multiples électrodes avec des potentiels indépendants pour être utilisés simultanément.
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Acknowledgments
Nous reconnaissons Melissa Grunlan pour des discussions utiles sur la formation de SAM. Cette recherche a été financée en partie par la Fondation Robert A. Welch (A-1585).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-[methoxypoly-(ethyleneoxy)propyl]-trimethoxysilane (PEG-silane) | Gelest Inc. | SIM6492.7 | 6-9 PEG units;molecular weight 450-600 g mol-1 |
| 2-mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M7522 | |
| Acetone | EMD Millipore | AX0120-8 | ACS grade |
| Catalase | Calbiochem | 219001-5MU | |
| Chlorobenzene | EMD Millipore | MK441908 | ACS grade |
| Ethylene glycol-bis(2-amin–thylether)-N,N,N’,N’-tetraacetic acid (EGTA) | Calbiochem | 324626 | |
| Glucose | EMD Millipore | DX0145-1 | |
| Glucose oxidase | MP Biomedicals | 100330 | |
| Guanosine-5’-[(α,Β)-methyleno]triphosphate, Sodium salt (GMPCPP) | Jena Biosciences, GmbH | NU-405s | |
| Guanosine-5’-triphosphate | Sigma-Aldrich | G8752 | |
| Isopropanol | EMD Millipore | PX1835-5 | ACS grade |
| Methyl isobutyl ketone (MIBK) | Fisher Scientific | AC12739-0010 | |
| Paclitaxel (taxol) | Calbiochem | 580555 | |
| Piperazine-N,N’’-bis(2-ethanesulfonic acid) (PIPES) | Sigma-Aldrich | P1851 | |
| Polymethylmethacrylate (PMMA) | Brewer Science, Inc. | 950K | molecular weight 950K |
| Rhodamine tubulin | Cytoskeleton, Inc. | T331M | from bovine brain 99% pure, lyophilized |
| Toluene | EMD Millipore | TX0735-5 | ACS grade |
| Tubulin | Cytoskeleton, Inc. | T238 | from bovine brain 99% pure, lyophilized |
No. 1 borosilicate glass coverslips (22 X 50 mm) were purchased from VWR. Polished electronic grade p-type <111> silicon wafers were purchased from Addison Engineering, Inc. High-purity silver paint was obtained from Structure Probe, Inc. (Catalog # 5001 AB). Insulated fine gauge copper magnet wire (~ 0.08 mm (0.003”) diameter) can be obtained from electronic supply companies. |
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References
- Tubulin Polymerization with GTP/GMPCPP/Taxol [Internet]. , Harvard University. Cambridge, Ma. Available from: http://mitchison.med.harvard.edu/protocols/poly.html (2009).
- Flow Cell Assays with Microtubules: Motility/Dynamics [Internet]. , Harvard University. Cambridge, Ma. Available from: http://mitchison.med.harvard.edu/protocols/flowcell.html (2009).
- Handbook of Microlithography, Micromachining, and Microfabrication: Microlithography. Rai-Choudhury, P. , SPIE Press. Bellingham, WA. (1997).
