Bottenfärg Self-monterade monolager på microelectrodes för mönstring Biomolekyler

Summary

Vi presenterar ett förfarande för att bilda en poly (etylenglykol) egna sammansatta cellslager (PEG-SAM) på ett kiselsubstrat med guld microelectrodes. PEG-SAM bildas i ett enda steg och förhindrar påväxt på kisel och guld ytor. Elektrofores används sedan för mönstring biomolekyler ner till nanoskala.

Abstract

Vi presenterar ett förfarande för att bilda en poly (etylenglykol) (PEG) trimethoxysilane egna sammansatta monolager (SAM) på ett kiselsubstrat med guld microelectrodes. PEG-SAM bildas i en enda församling steg och förhindrar påväxt på kisel och guld ytor. SAM används för att bestryka microelectrodes mönstrade med standard, positiv-tone litografi. Använda mikrotubuli som ett exempel, tillämpar vi en DC-spänning för att förmå elektrofores migration till SAM-belagda elektroden i ett reversibelt sätt. Ett flöde kammare används för avbildning av elektrofores migration och mikrotubuli mönstring

Protocol

Beredning av reagenser

Förbered RÖR buffert (80 mm rör, 1mm MgCl _2, 1mm EGTA, justerat till pH 6,8 med KOH). Alikvotera och lagra glukos oxidas, katalas och glukos vid -70 ° C och Taxol vid -20 ° C enligt befintliga protokoll. ^1,2 Alikvotera och lagra tubulin vid -70 ° C enligt instruktionerna från leverantören.

Mönster Au microelectrodes med litografi

1. Skär kiselskivor i 1 cm-1,5 cm substrat med hjälp av en skrivare eller wafer saxen. Rengör substrat genom att placera dem i en bägare med tillräckligt aceton för att täcka dem och Sonikera i 5 minuter. Utan att låta substrat för att torka, skölj dem i färsk aceton, och sedan skölj omedelbart i isopropanol och torka med hjälp av kväve.
2. Tillverka Au microelectrodes på den rena substrat med vanliga, positiva-ton fotolitografi eller elektronstrålelitografi, beroende på storleken på de önskade funktionerna. ³ Vid utformningen mönstret geometri, hålla diameter på varje elektrod mönster under 100 mikrometer för att säkerställa täckning av PEG SAM (beskrivs i nästa avsnitt). Inkludera kontakt kuddar (~ 300 mm ²⁾ placerad 300 till 500 mm från mönstret med en 1 mm linje som förbinder kardborrebandet med elektrod (bild 1). Placera litografiska mönster nära mitten av underlaget för att ge plats runt mönster för montering flödet kammaren.
   
   Figur 1. Exempel på geometri. Vänligen klicka här för att se en större version av figur 1.
3. Efter utveckling av mönstret i motstå lagret, skrapa en rad i motstå från kontakt pad till kanten av substrat med hjälp av pincett (Figur 1). Vid metall nedfall kommer repa tillåter elektrisk kontakt mellan elektroden och kanten på underlaget. En deposition kammare, helst med två källor, används för att deponera metallager. Elektroderna bildas genom nedfall av 2 nm av Cr (för vidhäftning) följt av 6 nm från Au, utan att bryta vakuum. En kvartskristall mikrovåg utrustade inne i kammaren kan användas för att mäta tjockleken på filmer under nedfall.

Förbered SAM

1. Värm och ugn på en väl ventilerad plats till 75 ° C. Förbered silaniseringen lösningen genom att tillsätta 20 ml toluen till en 250 ml glasbägare. Tillsätt sedan 1 ml PEG-silan (5% v / v) till toluen med hjälp av en plast pipett. Blanda i PEG-silan väl genom att pipettera upp och ner 5 till 10 gånger och sedan omrörning med pipett i 30 sekunder.
2. Placera mönstrade prover i bägaren med den mönstrade sidan uppåt och se till att de är helt nedsänkt i PEG-silan toluen-lösning och är jämnt fördelade över botten av bägaren. Placera bägaren i ugnen och grädda 18 till 21 timmar vid 75 ° C. Medan SAM bildar, förbereda counterelectrode (se nedan) och montera ytterligare komponenter som krävs för de återstående stegen.
3. Efter 18-21 timmar i ugnen, bör toluen avdunstar lämnar mönstrade prover i en trögflytande PEG-silan rester. Tillsätt 20 ml toluen i den bägare och njuta proverna i 1-2 minuter. Ta bort proverna från bägaren och skölj med toluen, sedan isopropanol, och slutligen torka med kväve. Vid det här laget bör de prover som ser rent och SAM-lagret ska vara osynliga för blotta ögat. SAMs förberedd på detta sätt är användbara för upp till två dagar vid förvaring i svalt torrt (25 ° C, måttlig fuktighet). Misslyckade SAM bildandet resulterar i en grumlig eller ojämnt färgade rester beläggning på ytan.

Fabricera counterelectrode

I samma nedfall kammare inställningar används för mikroelektrod nedfall, gör en counterelectrode genom att deponera 1 nm av Cr, följt av 4 nm Au på en 22 x 50 mm Nr 1 eller Nr 0 glas täckglas. Den counterelectrode bör vara nästan transparent med en ljusgrå eller rosa nyans. Förvara counterelectrode belagda-side-up i en petriskål att hålla den ren.

Polymerisera tubulin till MT

1. Tina omärkt tubulin och Rhodamine tubulin och omedelbart kombinera i förhållandet 1:02 märkt att omärkta för att få ljusa MTS. Blanda genom att pipettera upp och ned flera gånger. Polymerisera tubulin för 20-40 minuter i ett uppvärmt vattenbad vid 37 ° C. Längden på MT kommer att bli större för längre polymerisation gånger. Medan tubulin är polymerisation, förbereda ett RÖR-Taxol buffert genom att lägga till Taxol till 20 mm i ett mikrocentrifugrör innehåller RÖR buffert. Blanda Taxol väl genom att pipettera upp och ned flera gånger och vortexa och sedan placera röret i den uppvärmda badet vid 37 ° C. Efter polymerisering, späd MTS med 1 / 100 i varma RÖR-Taxol buffert och sköldfrån ljus. MT bereds på detta sätt kommer att förlänga tiden och bunt, som kan reduceras genom ytterligare spädning.
2. Förbered en 10x syre sophantering blandning (OS) genom att kombinera 30 ml kalla rör buffert (0-4 ° C), 5 ml 50% 2-merkaptoetanol, 5 ml glukos oxidas, 5 ml katalas och 5 ml glukos. ² glukos bör läggas sist. Blanda genom att pipettera upp och ned 3-5 gånger efter att du lagt varje komponent. Placera OS blandningen på is, det kommer att vara effektiv i ca 2 timmar.
3. Kontrollera att MT polymerisation var framgångsrik och att MT är stabila under flera minuter av fluorescens excitation bild av de förberedda MT med 1x OS blanda. För avbildning MTS förberedda på detta sätt, se till att använda en excitation / emission silkombinationen lämplig för Rhodamine fluorescens. Bestäm bästa bruksspädningen för avbildning enskilda trådar genom att ytterligare späda MTS med 1 / 10 till 1 / 100 med RÖR buffert och avbildning med 1x OS blanda.
4. Förbered ett flöde kammaren genom sandwiching en stor (22 x 50 mm) och små (22 x 22 mm) glas täckglas med två bitar av dubbelhäftande tejp placeras 2-3 mm från varandra. Bandet är lätt att skära i remsor genom att placera den på en glasplatta och skär med ett rakblad. Inför ett par mikroliter av MTS i flödet cellen med hjälp av en mikropipett. För hög förstoring bildbehandling, får långa arbetsdagar avstånd målen krävas för avbildning övre yta flödet kammaren. Avståndet från täckglas / provets yta på ovansidan av flödet kammaren bestäms av tjockleken på bandet och bör 60-100 mm.

Mönster MT med elektrofores

1. Förbered en elektrofores kammare genom att placera två tunna remsor av dubbelhäftande tejp över mönstrade, SAM-belagd prov så att elektroden är mellan strips med den anslutande vägen kör vinkelrätt mot bandet (Fig. 2). Placera counterelectrode på dubbelhäftande tejp med metallen sidan röra tejpen så att kanten av provet skjuter ut counterelectrode med ca 3 mm (Fig. 2). Klipp flera 15 cm längder av den isolerade koppar magneten tråd och band 1 cm av isoleringen bort av båda ändar. Fäst en kabel till den exponerade Au delen av substratet med en liten droppe av silver färg samtidigt se till att undvika att göra elektrisk kontakt med counterelectrode (detta kan kontrolleras med en multimeter). Fäst en andra kabel till counterelectrode med silver färg. Sladdar fäst med silver färg kan ytterligare säkras med proverna med tejp.
   
   Figur 2. Flödescell montering för ett inverterat fluorescensmikroskop. Vänligen klicka här för att se en större version av figur 2.
2. Introducera MT på önskad spädning med RÖR buffert i kombination med OS i 1x slutlig koncentration. Bild på 20X förstoring och leta reda på mönstret på kiselskiva innan en spänning. Alternativt kan flödet kammaren tätas med nagellack för att förhindra vätskeflöde och MT migration i planet av flödet kammaren.
3. Applicera en spänning upp till 1 V och observera migration av MTS. Lägre spänningar (ner till ca 0,5 V) kan användas om reversibla fångst av MTS önskas, men detta kräver tätning flödet kammaren för att förhindra lateral drift. Nagellack fungerar bra för tätning av öppna ändarna av flödet kammaren. Vid spänningar över cirka 0,7 V, kan vissa MT vidhäftning ses på mönstret, men det kommer att vara svag. Vid spänningar över ca 0,9 V kommer MT migration vara snabbare och vidhäftningen blir starkare. Ovan om 1,2 V sannolikheten för att framkalla elektrolys (gas bubblor bildas) och även för att förstöra microelectrodes ökar betydligt. Migration kan spåras genom att justera det vertikala planet i fokus i mikroskop. Om utförts korrekt, kommer MTS lokalisera vid elektroden ytor.

Discussion

Migration av MTS är enkelt visualiseras med fluorescensmikroskopi på grund av deras ljusstyrka och den låga bakgrundsfluorescens. Metoden är generellt tillämplig på biomolekyler mönstring, eftersom den bara kräver att biomolekyler förmås att bära ett netto kostnad av lämplig justering av pH. Electroosmosis undviks i denna konfiguration, eftersom det inte finns några laddade ytor såsom kiseldioxid väggarna används i kapillärelektrofores.

Flera ändringar av denna metod är möjliga. Tätning ändarna av flödet kammaren är kritiska för att observera reversibilitet eftersom avdunstning från de öppna ändarna orsakerna bulk vätskeflöde och oönskade MT migration. Oxidation av kiselskiva före litografiska mönstring kommer att förhindra överledning genom substratet, vilket möjliggör multipla elektroder med oberoende potential att användas samtidigt.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-[methoxypoly-(ethyleneoxy)propyl]-trimethoxysilane (PEG-silane)	Gelest Inc.	SIM6492.7	6-9 PEG units;molecular weight 450-600 g mol-1
2-mercapt–thanol	Sigma-Aldrich	M7522
Acetone	EMD Millipore	AX0120-8	ACS grade
Catalase	Calbiochem	219001-5MU
Chlorobenzene	EMD Millipore	MK441908	ACS grade
Ethylene glycol-bis(2-amin–thylether)-N,N,N’,N’-tetraacetic acid (EGTA)	Calbiochem	324626
Glucose	EMD Millipore	DX0145-1
Glucose oxidase	MP Biomedicals	100330
Guanosine-5’-[(α,Β)-methyleno]triphosphate, Sodium salt (GMPCPP)	Jena Biosciences, GmbH	NU-405s
Guanosine-5’-triphosphate	Sigma-Aldrich	G8752
Isopropanol	EMD Millipore	PX1835-5	ACS grade
Methyl isobutyl ketone (MIBK)	Fisher Scientific	AC12739-0010
Paclitaxel (taxol)	Calbiochem	580555
Piperazine-N,N’’-bis(2-ethanesulfonic acid) (PIPES)	Sigma-Aldrich	P1851
Polymethylmethacrylate (PMMA)	Brewer Science, Inc.	950K	molecular weight 950K
Rhodamine tubulin	Cytoskeleton, Inc.	T331M	from bovine brain 99% pure, lyophilized
Toluene	EMD Millipore	TX0735-5	ACS grade
Tubulin	Cytoskeleton, Inc.	T238	from bovine brain 99% pure, lyophilized
No. 1 borosilicate glass coverslips (22 X 50 mm) were purchased from VWR. Polished electronic grade p-type <111> silicon wafers were purchased from Addison Engineering, Inc. High-purity silver paint was obtained from Structure Probe, Inc. (Catalog # 5001 AB). Insulated fine gauge copper magnet wire (~ 0.08 mm (0.003”) diameter) can be obtained from electronic supply companies.