Microelectrodes पर patterning biomolecules के लिए सेल्फ इकट्ठे monolayers antifouling

Summary

हम सोने microelectrodes के साथ एक सिलिकॉन सब्सट्रेट पर एक पाली (ethylene glycol) monolayer आत्म इकट्ठे (खूंटी - एसएएम) के गठन के लिए एक प्रक्रिया मौजूद है. खूंटी - एसएएम एक भी कदम में गठन किया गया है और सिलिकॉन और सोने की सतहों पर biofouling रोकता है. वैद्युतकणसंचलन तो patterning biomolecules के लिए प्रयोग किया जाता है के nanoscale के लिए नीचे.

Abstract

हम सोने microelectrodes के साथ एक सिलिकॉन सब्सट्रेट पर एक पाली (ethylene glycol) (खूंटी) trimethoxysilane monolayer आत्म इकट्ठे (एसएएम) के गठन के लिए एक प्रक्रिया मौजूद है. खूंटी - एसएएम एक एकल विधानसभा कदम में बनाई है और सिलिकॉन और सोने की सतहों पर biofouling रोकता है. सैम मानक, लिथोग्राफी सकारात्मक टोन के साथ नमूनों कोट microelectrodes करने के लिए प्रयोग किया जाता है. एक उदाहरण के रूप में microtubule का उपयोग करना, हम एक डीसी वोल्टेज के लिए एक प्रतिवर्ती तरीके सैम - लेपित इलेक्ट्रोड electrophoretic प्रवास प्रेरित लागू होते हैं. एक प्रवाह कक्ष electrophoretic प्रवास और microtubule patterning इमेजिंग के लिए प्रयोग किया जाता है

Protocol

अभिकर्मकों की तैयारी

पाइप बफर (80 मिमी पाइप, 1mm MgCl _2, 1mm EGTA KOH के साथ 6.8 पीएच को समायोजित) तैयार करें . विभाज्य और दुकान ग्लूकोज oxidase, catalase -70 और ग्लूकोज डिग्री सेल्सियस और -20 पर taxol डिग्री सेल्सियस मौजूदा प्रोटोकॉल के अनुसार ^1,2 और -70 पर दुकान ट्यूबिलिन विभाज्य. डिग्री सेल्सियस आपूर्तिकर्ता द्वारा शामिल निर्देशों के अनुसार.

पैटर्न Au लिथोग्राफी का उपयोग microelectrodes

1. 1 'सेमी 1.5 सेमी substrates के एक मुंशी या वफ़र कटर का उपयोग में सिलिकॉन wafers कट. एक बीकर में उन्हें पर्याप्त एसीटोन के साथ उन्हें कवर और 5 मिनट के लिए sonicate रखने के द्वारा substrates साफ़. Substrates के शुष्क करने की अनुमति के बिना, उन्हें ताजा एसीटोन में कुल्ला, तो तुरंत isopropanol और सूखी का उपयोग नाइट्रोजन में कुल्ला.
2. साफ मानक, photolithography सकारात्मक टोन या इलेक्ट्रॉन बीम लिथोग्राफी का उपयोग वांछित सुविधाओं के आकार पर निर्भर करता है, substrates ^पर Au microelectrodes 3 जब पैटर्न ज्यामिति डिजाइनिंग, 100 माइक्रोन नीचे प्रत्येक इलेक्ट्रोड पैटर्न के व्यास रखने के लिए कवरेज सुनिश्चित बनाना. खूंटी सैम (अगले भाग में वर्णित). संपर्क पैड (~ 300 मिमी ²⁾ 500 मिमी के लिए एक 1 मिमी लाइन इलेक्ट्रोड (1 छवि) के साथ पैड को जोड़ने के साथ पैटर्न से 300 तैनात शामिल करें. सब्सट्रेट के बीच निकट lithographic पैटर्न प्लेस प्रवाह चैम्बर कोडांतरण के लिए पैटर्न के चारों ओर अंतरिक्ष की अनुमति है.
   
   चित्रा 1 नमूना ज्यामिति. कृपया यहाँ क्लिक करें संख्या 1 के एक बड़ा संस्करण देख.
3. परत विरोध में पैटर्न के विकास के बाद, संपर्क पैड से चिमटी (1 छवि) का उपयोग सब्सट्रेट के किनारे करने के लिए विरोध में एक लाइन खरोंच. धातु बयान पर, खरोंच इलेक्ट्रोड और सब्सट्रेट के किनारे के बीच बिजली के संपर्क की अनुमति देगा. एक बयान कक्ष, दो स्रोतों के साथ अधिमानतः धातु की परत जमा करने के लिए प्रयोग किया जाता है. सीआर के 2 एनएम के बयान (आसंजन के लिए) Au के 6 एनएम द्वारा वैक्यूम को तोड़ने के बिना, बाद से इलेक्ट्रोड का गठन कर रहे हैं. एक क्वार्ट्ज क्रिस्टल Microbalance कक्ष के अंदर लैस बयान के दौरान फिल्मों की मोटाई मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

सैम की तैयारी

1. पहले से गरम करना और एक अच्छी तरह संवातित क्षेत्र में 75 ओवन डिग्री सेल्सियस Silanization समाधान एक 250 एमएल कांच बीकर टोल्यूनि के 20 एमएल जोड़कर तैयार करें. फिर टोल्यूनि के लिए एक खूंटी silane एमएल (अर्थात 5% v / v) जोड़ने एक प्लास्टिक विंदुक का उपयोग कर. ऊपर और नीचे pipetting 5 से 10 बार और फिर 30 सेकंड के लिए विंदुक के साथ सरगर्मी से खूंटी silane अच्छी तरह मिक्स.
2. नमूनों की ओर ऊपर का सामना करना पड़ के साथ बीकर में नमूने नमूनों प्लेस, यकीन है कि वे पूरी तरह से खूंटी silane टोल्यूनि समाधान में डूबे हुए हैं और समान रूप से बीकर के नीचे भर में दूरी बना. ओवन में बीकर प्लेस और 75 में 18 से 21 घंटे के सेंकना डिग्री सेल्सियस जबकि सैम गठन है, counterelectrode तैयार (नीचे देखें) और किसी भी अतिरिक्त शेष चरणों के लिए आवश्यक घटकों को इकट्ठा.
3. ओवन में 18-21 घंटे के बाद, टोल्यूनि एक चिपचिपा खूंटी silane अवशेषों में नमूने नमूनों छोड़ने लुप्त हो जाना चाहिए. बीकर टोल्यूनि के 20 एमएल जोड़ें और 1-2 मिनट के लिए नमूने सोख. बीकर से निकालें नमूने और टोल्यूनि, तो isopropanol के साथ कुल्ला, और अंत में नाइट्रोजन के साथ शुष्क. इस बिंदु पर, नमूने साफ देखो और सैम परत नग्न आंखों के लिए अदृश्य होना चाहिए चाहिए. SAMs इस तरह से तैयार करने के लिए दो दिन के लिए प्रयोग करने योग्य हैं जब शांत सूखे की स्थिति (25 डिग्री सेल्सियस, मध्यम आर्द्रता) के तहत संग्रहीत. एक बादल या असमान सतह पर hued अवशेषों कोटिंग में असफल सैम गठन परिणाम.

Counterelectrode बनाना

Microelectrode बयान के लिए इस्तेमाल किया वही बयान चैम्बर सेटअप में, 1 करोड़ की एनएम, एक 22 x 50 मिमी नंबर 1 या सं 0 कांच coverslip पर Au के 4 एनएम द्वारा पीछा जमा करके एक counterelectrode बनाते हैं. counterelectrode लगभग एक हल्के भूरे रंग या गुलाबी रंग के साथ पारदर्शी होना चाहिए. Counterelectrode लेपित पक्ष को एक पेट्री डिश में इसे साफ रखने के लिए स्टोर.

लाख टन में polymerize ट्यूबिलिन

1. पिघलना ट्यूबिलिन और rhodamine ट्यूबिलिन unlabeled और तुरंत 01:02 के अनुपात करने के लिए उज्ज्वल लाख टन प्राप्त unlabeled लेबल पर गठबंधन. ऊपर और नीचे pipetting कई बार मिक्स. एक गर्म पानी के स्नान में 20-40 मिनट के लिए 37 पर ट्यूबिलिन polymerize डिग्री सेल्सियस टन की लंबाई अब polymerization के समय के लिए अधिक किया जाएगा. जबकि ट्यूबिलिन polymerizing है, 20 मिमी के लिए एक microcentrifuge पाइप बफर युक्त ट्यूब में taxol जोड़ने के द्वारा एक पाइप - taxol बफर तैयार करते हैं. Taxol अच्छी तरह से ऊपर और नीचे pipetting कई बार और vortexing द्वारा मिक्स और तब गर्म स्नान में 37 ट्यूब जगह डिग्री सेल्सियस Polymerization के बाद, गर्म बफर पाइप taxol और ढाल में 100 / 1 लाख टन पतलाप्रकाश से. इस तरह से तैयार लाख टन पर समय और बंडल, जो आगे कमजोर पड़ने से कम किया जा सकता है है बढ़ाना होगा.
2. 30 एमएल पाइप ठंड (0-4 डिग्री सेल्सियस) बफर, 50 2 - mercaptoethanol%, 5 एमएल ग्लूकोज oxidase, 5 एमएल catalase, और 5 एमएल ग्लूकोज के 5 एमएल के संयोजन के द्वारा एक 10x ऑक्सीजन सफाई मिश्रण तैयार करें ^(ओएस) 2 ग्लूकोज. पिछले जोड़ा जाना चाहिए. Pipetting और नीचे प्रत्येक घटक जोड़ने के बाद 3-5 बार मिक्स. बर्फ पर ओएस मिश्रण प्लेस, के बारे में 2 घंटे के लिए प्रभावी रहेगा.
3. सत्यापित करें कि मीट्रिक टन polymerization सफल रहा था और टन 1x ओएस मिश्रण के साथ तैयार लाख टन इमेजिंग द्वारा प्रतिदीप्ति उत्तेजना के कई मिनट के अंतर्गत स्थिर रहे हैं कि. इमेजिंग के लिए इस रास्ते में तैयार टन / उत्तेजना उत्सर्जन फिल्टर rhodamine प्रतिदीप्ति के लिए उपयुक्त संयोजन का उपयोग सुनिश्चित करें. आगे 1 / 10 1 / 100 1x ओएस मिश्रण के साथ पाइप बफर और इमेजिंग का उपयोग टन गिराए द्वारा इमेजिंग व्यक्तिगत filaments के लिए सबसे अच्छा काम कर कमजोर पड़ने का निर्धारण करते हैं.
4. डबल पक्षीय टेप के दो टुकड़े 2-3 मिमी अलग रखा के साथ एक (22 x 50 मिमी) बड़े और छोटे (22 x 22 मिमी) कांच coverslip sandwiching द्वारा एक प्रवाह कक्ष तैयार. टेप आसानी से यह एक गिलास स्लाइड पर रखने और एक धार के साथ काटने से स्ट्रिप्स में कटौती. प्रवाह सेल में एक micropipette का उपयोग लाख टन की कुछ microliters परिचय. इमेजिंग के लिए उच्च वृद्धि, लंबे समय तक काम दूरी उद्देश्यों प्रवाह कक्ष के ऊपरी सतह इमेजिंग के लिए आवश्यक हो सकता है. प्रवाह कक्ष के ऊपरी सतह coverslip / नमूना की सतह से दूरी टेप की मोटाई से निर्धारित होता है और 60-100 मिमी होना चाहिए.

पैटर्न लाख टन वैद्युतकणसंचलन का उपयोग

1. नमूनों, सैम लेपित ऐसी है कि इलेक्ट्रोड जोड़ने टेप (छवि 2) के लिए सीधा चल रहे पथ के साथ स्ट्रिप्स के बीच नमूना भर में डबल पक्षीय टेप के दो पतली स्ट्रिप्स रखकर एक वैद्युतकणसंचलन कक्ष तैयार है. डबल पक्षीय टेप पर धातु पक्ष के साथ इस तरह के टेप को छू counterelectrode प्लेस के बारे में 3 मिमी (छवि 2) द्वारा नमूना counterelectrode overhangs के किनारे. कट कई अछूता तांबे चुंबक तार के 15 सेमी लंबाई और 1 सेमी इन्सुलेशन के दोनों सिरों के बंद पट्टी. उजागर सब्सट्रेट चांदी के रंग की एक छोटी सी बूंद का उपयोग जबकि ख्याल रख रही counterelectrode (यह एक multimeter के साथ जाँच की जा सकती है) के साथ विद्युत संपर्क बनाने से बचने के Au क्षेत्र के लिए एक तार संलग्न. चांदी के रंग का उपयोग counterelectrode एक दूसरे के तार संलग्न. चांदी के रंग के साथ संलग्न तार आगे टेप के साथ नमूने के लिए सुरक्षित किया जा सकता है.
   
   चित्रा एक औंधा प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी के लिए प्रवाह 2. सेल विधानसभा . कृपया यहाँ क्लिक करें आंकड़ा 2 का एक बड़ा संस्करण देख.
2. वांछित पाइप 1x अंतिम एकाग्रता में ओएस के साथ संयुक्त बफर का उपयोग कमजोर पड़ने पर लाख टन का परिचय. 20X आवर्धन छवि और एक वोल्टेज लागू करने से पहले सिलिकॉन वफ़र पर पैटर्न का पता लगाने. वैकल्पिक रूप से, प्रवाह चैम्बर नेल पॉलिश करने के लिए मीट्रिक टन तरल पदार्थ और प्रवाह चैम्बर के विमान में प्रवास के प्रवाह को रोकने के का उपयोग बंद किया जा सकता है.
3. एक वोल्टेज लागू वी करने के लिए 1 लाख टन के प्रवास का पालन. कम voltages (के बारे में 0.5 वी के लिए नीचे) अगर लाख टन की प्रतिवर्ती फँसाने वांछित है इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन इस प्रवाह चैम्बर सील पार्श्व बहाव को रोकने की आवश्यकता है. नेल पॉलिश प्रवाह कक्ष के खुले छोर को सील करने के लिए अच्छी तरह से काम करता है. के बारे में 0.7 वी ऊपर voltages पर, कुछ मीट्रिक टन आसंजन पैटर्न पर देखा जा सकता है, हालांकि यह कमजोर हो जाएगा. वी 0.9 के बारे में ऊपर voltages पर, मीट्रिक टन प्रवास तेजी से हो, और आसंजन मजबूत हो जाएगा. के बारे में 1.2 वी ऊपर उत्प्रेरण (गैस बुलबुला गठन) microelectrodes को नष्ट करने के लिए और इलेक्ट्रोलीज़ भी संभावना काफी बढ़ जाती है. प्रवासन माइक्रोस्कोप के ध्यान के ऊर्ध्वाधर विमान का समायोजन द्वारा लगाया जा सकता है है. यदि सही ढंग से बाहर किया, टन इलेक्ट्रोड सतहों में स्थानीयकरण.

Discussion

लाख टन के प्रवास को आसानी से क्योंकि उनकी चमक और कम पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति के प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग कल्पना है. विधि आम तौर पर है biomolecule patterning के लिए लागू है, के रूप में यह केवल आवश्यकता है कि biomolecules बफर पीएच के उपयुक्त समायोजन द्वारा शुद्ध प्रभार ले जाने के लिए प्रेरित किया जा. Electroosmosis इस सेटअप में बचा है क्योंकि वहाँ सिलिका केशिका electrophoresis में इस्तेमाल किया दीवारों के रूप में कोई चार्ज सतहों हैं.

इस विधि के कई संशोधन संभव हो रहे हैं. प्रवाह चैम्बर के सिरों को सील उलटने निरीक्षण क्योंकि खुले छोर से वाष्पीकरण थोक तरल प्रवाह का कारण बनता है और अवांछनीय मीट्रिक टन प्रवास के लिए महत्वपूर्ण है. Lithographic patterning से पहले सिलिकॉन वफ़र के ऑक्सीकरण सब्सट्रेट के माध्यम से चालन को रोकने के लिए, एकाधिक इलेक्ट्रोड के लिए स्वतंत्र के लिए एक साथ इस्तेमाल किया जा क्षमता के साथ की अनुमति होगी.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-[methoxypoly-(ethyleneoxy)propyl]-trimethoxysilane (PEG-silane)	Gelest Inc.	SIM6492.7	6-9 PEG units;molecular weight 450-600 g mol-1
2-mercapt–thanol	Sigma-Aldrich	M7522
Acetone	EMD Millipore	AX0120-8	ACS grade
Catalase	Calbiochem	219001-5MU
Chlorobenzene	EMD Millipore	MK441908	ACS grade
Ethylene glycol-bis(2-amin–thylether)-N,N,N’,N’-tetraacetic acid (EGTA)	Calbiochem	324626
Glucose	EMD Millipore	DX0145-1
Glucose oxidase	MP Biomedicals	100330
Guanosine-5’-[(α,Β)-methyleno]triphosphate, Sodium salt (GMPCPP)	Jena Biosciences, GmbH	NU-405s
Guanosine-5’-triphosphate	Sigma-Aldrich	G8752
Isopropanol	EMD Millipore	PX1835-5	ACS grade
Methyl isobutyl ketone (MIBK)	Fisher Scientific	AC12739-0010
Paclitaxel (taxol)	Calbiochem	580555
Piperazine-N,N’’-bis(2-ethanesulfonic acid) (PIPES)	Sigma-Aldrich	P1851
Polymethylmethacrylate (PMMA)	Brewer Science, Inc.	950K	molecular weight 950K
Rhodamine tubulin	Cytoskeleton, Inc.	T331M	from bovine brain 99% pure, lyophilized
Toluene	EMD Millipore	TX0735-5	ACS grade
Tubulin	Cytoskeleton, Inc.	T238	from bovine brain 99% pure, lyophilized
No. 1 borosilicate glass coverslips (22 X 50 mm) were purchased from VWR. Polished electronic grade p-type <111> silicon wafers were purchased from Addison Engineering, Inc. High-purity silver paint was obtained from Structure Probe, Inc. (Catalog # 5001 AB). Insulated fine gauge copper magnet wire (~ 0.08 mm (0.003”) diameter) can be obtained from electronic supply companies.