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Summary

Dieses Video ist eine kolloidale Coomassie G-250 Färbung Protokoll nach Kang popularisieren<em> Et al.</em> Für den Nachweis von durchschnittlich 4 ng Protein in Gelen. Die Färbung ist innerhalb von 2 Stunden und ohne jegliche Anstrengung abgeschlossen. Wir verwenden routinemäßig Kang-Protokoll für analytische Zwecke in Gel-Basis Proteomik.

Abstract

Coomassie Brilliant Blue (CBB) ist ein Farbstoff der Regel für die Visualisierung von Proteinen durch SDS-PAGE getrennt verwendet, bietet eine einfache Färbung und hohe Quantifizierung. Darüber hinaus ist es vollständig kompatibel mit massenspektrometrischen Identifizierung von Proteinen. Doch trotz dieser Vorteile ist CBB angesehen werden weniger empfindlich als Silber-oder Fluoreszenz-Färbungen und daher nur selten zum Nachweis von Proteinen in der analytischen Gel-Basis Proteomik Ansätze verwendet.

Mehrere Verbesserungen der ursprünglichen Coomassie-Protokoll ¹ wurden unternommen, um die Empfindlichkeit der CBB zu erhöhen. Zwei wichtige Änderungen eingeführt wurden, um den Nachweis von low-reiche Proteine, die durch Umwandlung der Farbstoffmoleküle in kolloidalen Teilchen zu verbessern: Im Jahr 1988 angewendet Neuhoff und Kollegen 20% Methanol und höhere Konzentrationen von Ammoniumsulfat in die CBB G-250 basiert Färbelösung ^2, und im Jahr 2004 Candiano et al. etablierten Blue Silver mit CBB G-250 mit Phosphorsäure in Gegenwart von Ammoniumsulfat und Methanol ^3. Dennoch, all diese Modifikationen nur erlauben eine Detektion von etwa 10 ng Protein. Ein weit fameless Protokoll für kolloidale Coomassie-Färbung wurde von Kang et al. Im Jahr 2002, wo sie Neuhoff ist kolloidales CBB Färbeprotokoll geändert in Bezug auf die komplexierenden Substanzen. Anstelle von Ammoniumsulfat sie verwendet Aluminiumsulfat und Methanol wurde durch das weniger toxische Ethanol ⁴ ersetzt. Der Roman Aluminium-Färbung in Kang-Studie zeigte eine überlegene Empfindlichkeit, die so niedrig wie 1 ng / Band (Phosphorylase b) mit wenig Sensibilität Variation in Abhängigkeit von Proteinen entdeckt.

Hier zeigen wir Anwendung von Kang-Protokoll zur schnellen und sensitiven kolloidale Coomassie-Färbung von Proteinen in analytischen Zwecken. Wir zeigen die schnelle und einfache Protokoll mit zweidimensionalen Gels routinemäßig in unserer Arbeitsgruppe durchgeführt.

Protocol

Teil 1: Zweidimensionale (2-D)-Gelelektrophorese unter Verwendung cup-loading

1. IPG-Streifen Rehydratation und isoelektrische Fokussierung (IEF)
   • Rehydrieren Immobiline DryStrip Gele, pH 6-11 (7 cm) in 125 ul Rehydrationslösung [7 M Harnstoff, 2 M Thioharnstoff, 4% CHAPS, 50 mM hydroxyethyldisulfide und 2% IPG-Puffer pH 6-11] mit Immobiline DryStrip Reswelling Tray für mindestens 10 Stunden.
   • Lösen Sie ausgefallene Protein Probe in IEF-Probenpuffer [7 M Harnstoff, 2 M Thioharnstoff, 2% CHAPS, 2% ASB-14, 50 mM hydroxyethyldisulfide und 2% IPG-Puffer pH 6-11] entspricht 60-100 ug Protein pro 100 ul .
   • Nach Solubilisierung (mindestens 30 Minuten bei Raumtemperatur), gelten Proteinprobe über anodische cup-loading mit Probengefäße. Das Volumen der Tasse ist 100 ul (Manifold Tassen ermöglichen bis zu 150 ul).
     Hinweis: Sie können größere Probenmengen zu laden, wenn Sie eine Low-Voltage Schritt am Anfang der Fokussierung Protokoll und füllen die Becher legen, solange es noch ein Flüssigkeitsfilm in der Tasse!
   • Führen Sie die isoelektrische Fokussierung für 11.1 kVh in Gradienten-Modus in der Multiphor II Elektrophorese-Einheit.
2. Äquilibrierung und SDS-PAGE
   • Nach IEF wurden die IPG-Streifen auf Reduktion und Alkylierung unterzogen, jedes Mal 15 Minuten auf einem Schüttler mit 1% Dithiothreitol und 2,5% iodoacetamide jeweils in Gleichgewichtseinstellung Lösung [50 mM Tris-HCl/pH 8,8, 6 M Harnstoff, 30% Glycerin und 2% SDS].
   • Spülen Sie das Gleichgewicht Streifen mit H ₂ O und blot sie auf Whatman-Papier, um überschüssige Äquilibrierungspuffer zu entfernen. Danach tauchen die Streifen in SDS-Laufpuffer (1X).
   • Zweite Dimension wird durch SDS-PAGE auf eine vertikale Elektrophorese-Systeme mit einer Gesamtleistung Acrylamid-Konzentration von 12% durchgeführt. Die äquilibriert IPG-Streifen wurden auf der Oberseite des Trenngelen platziert und mit heißen Agarose-Lösung [0,5% Agarose in Laufpuffer mit Bromphenolblau].
   • Die Proteine ​​wurden für 2,5 Stunden getrennt, beginnend bei 80 V für 15 Minuten mit 120 V eingehalten werden, bis der Farbstoff vor Erreichen der Unterseite des Gels Kassette.

Teil 2: Kolloidale Coomassie-Färbung mit CBB G-250

1. Färbelösungen
Hinweis: Für die Vorbereitung der Färbelösungen, Chemikalien mit hoher Qualität, wie analysenrein (pa) und Wasser von hoher Reinheit, wie Sie von Millipore Systeme (Milli-Q-Wasser) erhalten.

Coomassie-Lösung:		ad 2000 ml H 2 O
0,02% (w / v)	CBB G-250	0,4 g
5% (w / v)	Aluminiumsulfat-(14-18)-Hydrat	100 g
10% (v / v)	Ethanol (96%)	200 ml
2% (v / v)	Orthophosphorsäure (85%)	47 ml

Hinweis: Für die Vorbereitung der Färbelösung wurde die sequentielle Zugabe der Komponenten in der folgenden Reihenfolge einzuhalten:

1. zuerst auflösen Aluminiumsulfat in Milli-Q Wasser
2. danach add Ethanol, homogenisieren und mischen CBB G-250, um die Lösung
3. wie vor kurzem als Lösung vollständig gelöst ist, fügen Sie Phosphorsäure (die Einarbeitung der Säure zu der alkoholischen Medien lässt die Coomassie Moleküle aggregieren in ihre kolloidalen Zustand)
4. endlich füllen sich mit Milli-Q Wasser

Hinweis: die endgültige Färbung Lösung ist dunkel grün-bläuliche Aussehen und ist voller Partikel schwimmen um:

• Nicht Filtrat dieser Lösung!
• Wenn Sie die Reihenfolge der Zubereitung verändert, bekommt man eine violett-bläuliche Lösung, die weniger empfindlich ist.

Entfärbelösung:		ad 2000 ml H 2 O
10% (v / v)	Ethanol (96%)	200 ml
2% (v / v)	Orthophosphorsäure (85%)	47 ml

2. Färbeverfahren

• Nach der zweiten Dimension Trennung, entfernen Sie vorsichtig die Gele von den Glasplatten und überführen sie in eine Färbung Gericht mit Milli-Q Wasser gefüllt.
• Waschen Sie die Gele dreimal mit Milli-Q Wasser für 10 Minuten auf einer horizontalen Schüttler (unzureichende Reinigung führt zu einer schlechten Empfindlichkeit, weil die verbleibenden SDS auf den Gelen stört die Begrenzung der Farbstoff an das Protein).
• Schütteln Sie die Coomassie-Lösung vor Gebrauch auf die kolloidalen Teilchen gleichmäßig zu verteilen.
• Inkubieren Sie die Gele gut mit der Coomassie-Lösung durch Schütteln auf einem Schüttler abgedeckt für 2-12 Stunden. Diese Färbung erzeugt marginal Hintergrund, damit Sie die Färbung Fortschritt in zwischen zu beobachten.
  Hinweis: Nach 10 Minuten können Sie erste Protein-Spots erscheinen, innerhalb von 2 Stunden Inkubation über 80% Färbung zus Höchstmaß abgeschlossen ist. Seit fast 100% Färbung wird Inkubation über Nacht empfohlen. In einigen Fällen, wenn die Menge an Protein angefärbt ist riesig und die Lösung verwandelt sich in ein helles blau, ist eine Aktualisierung der Färbelösung notwendig.
• Nach der Färbung entfernen Sie die Coomassie-Lösung und spülen Sie die Gele zweimal mit Milli-Q Wasser.
  Hinweis: Sie können die Färbelösung solange Wiederverwendung als Teilchen noch verbleibenden, ansonsten verwerfen (bedenken Sie, dass Ihr Labor können besondere Vorschriften für die Entsorgung haben).
• Entfernen Sie kleben Farbpartikel aus der Färbung Schale mit einem fusselfreien Papiertuch und entfärben für 10 bis 60 Minuten.
  Hinweis: Sie können auch waschen die Gele nur mit Milli-Q Wasser, aber wir empfehlen nur für präparative Gele, denn es wird eine unregelmäßige, schwache Coomassie Film auf der Gele, die während des Scan-Verfahren entstehen dauern wird.
• Schließlich spülen die Gele zweimal mit Milli-Q Wasser: die Gele werden ihre ursprüngliche Dicke zu erreichen (der Alkohol-Säure-Medien macht die Gele schrumpfen) und Neutralisation in Wasser erhöht sich zusätzlich die Coomassie der Farbintensität.

Teil 3: Repräsentative Ergebnisse

Wenn Sie die oben beschriebenen Protokoll folgen, werden Sie auf Ihrem 2-D Gel unverwechselbaren gelöst und gut gefärbte dunkelblau Proteinspots zu bekommen. Auch eine 2-D-Gel mit Silber nach Shevchenko et al. ^5, ein Protokoll behauptete gute Empfindlichkeit und die Kompatibilität mit der Massenspektrometrie gebeizt Vergleich erreichen wir gleich Färbeergebnisse.

Abbildung 1: Das Endergebnis der Versuche beschrieben. Kang ist Coomassie-Protokoll (A) führt stark wie die Silberfärbung nach Shevchenko et al. (B) bei der Aufdeckung von Proteinen nach 2-D-Gelelektrophorese.

Teil 4: Tipps und Tricks

• Führen Sie einige Test-Färbungen, bevor es Ihre eigenen Samples. Für unerklärlichen Gründen berichteten wir manchmal, dass ein Protein von Interesse konnte nicht erfolgreich erkannt werden, auch wenn Milligramm angewendet wurden. In diesem Fall empfehlen wir, einige Verdünnungsreihe vorzubereiten, um die Empfindlichkeit zu testen.
• Wenn Sie einen niedrigen in-Gel-Detektion von Protein (en) in der Regel erfolglos Transfer vom Stapel, um das Trenngel in SDS-PAGE haben wird möglicherweise der Grund sein. Sie können nach wie klebrige Proteine ​​durch Färbung das komplette Gel einschließlich der Parkraum zu überprüfen.
• Für eine schnelle Überprüfung Ihrer isoelektrische Fokussierung Ergebnisse können Sie direkt färben die IPG-Streifen ohne weitere zweite Dimension Trennung.
• Gelegentlich drehen Sie die Gele während der Färbung, so dass sie gleichmäßig von beiden Seiten gefärbt sind (wenn Sie die Gele unbewegt zu halten, der Farbstoff nur bindet an einer Seite des Gels).
• Wir erlebten, dass die Lagerung der Färbelösung in einer dunklen Flasche erhöht die Lebensdauer (in transparenten Flaschen bis zu 4 Monate).
• Nach der Färbung und Dokumentation können Sie die Gele in den Kühlschrank für mehrere Jahre (wenn man saure Lösung fügen Sie vermeiden Kontaminationen durch Pilze).
• Entfärbung des Gels Stecker für einen tryptischen Verdaus können durch Erwärmen in einem Heizblock beschleunigt werden.

Discussion

Innovative oder nur ein weiterer Coomassie-Protokoll?

Im Moment gibt es mehrere Protokolle für Färbeverfahren mit Coomassie Brilliant Blue. Die meisten von ihnen aus kleineren oder größeren Modifikationen eines der am häufigsten verwendeten Protokolle, die von Neuhoff und seine Kollegen ^{haben 2 Ergebnisse.} Auch Kang-Protokoll auf Neuhoff-Formel basieren. Aber ist es wirklich eine Alternative Coomassie-Färbung für Proteomforschung? Wir werden Bild zwei Hauptthemen, Nachweisgrenze und Benutzerfreundlichkeit, zu beweisen, dass es definitiv eine positive Färbung Protokoll im Vergleich zu anderen Coomassie-Protokolle und auch Silber-und Fluoreszenz-Färbungen.

Focus I: Nachweisgrenze

In Kang Veröffentlichung, entdeckten sie mehrere Markerproteine ​​bis zu 1 ng / Bande (Abbildung 2). Aber unserer Meinung nach eine Nachweisgrenze von 4-8 ng / Band ist eher die Praxis (Tabelle 1) zusammen. Sie weiter diskutiert überlegen Empfindlichkeitsstufen sowohl in Bezug auf eine kolloidale Coomassie-Protokoll mit CBB G-250 in Phosphorsäure, Ammoniumsulfat und Methanol, und eine saure Silberfärbung (Silver Stain Plus Kit) von Amersham Pharmacia Biotechnology.

Abbildung 2: Repräsentative SDS-Gel herausgegeben von Kang et al. Das zeigt die Kraft des modifizierten CBB-G250-Protokoll. 250 ng / Band Proteine ​​wurden bei den meisten linken und 2-fach verdünnt, um die rechte Seite nacheinander geladen werden.

Tabelle 1: Färbung Grenzen für Standard-Proteine ​​aus Kang Publikation im Vergleich zu einer realistischeren Schwelle für die Protein-Erkennung übernommen.

Protein	MW [kDa]	Protein Menge [ng] (virtuell vs ernst)
Myosin	220	1 / 4
b-Galactosidase	116	1 / 4
Phosphorylase b	97	1 / 4
Rinderserumalbumin	66	2 / 4
Ovalbumin	45	4 / 8

Zur Bestätigung dieser Nachweisgrenzen und weiter zu validieren Kang-Färbung Methode, die wir haben unsere eigenen Testreihen auf gemeinsame Laemmli SDS-Gele mit Molekulargewichtsmarker durch kommerziell erhältliche Fluoreszenzfärbung Lösungen wie Sypro Ruby (BioRad) und Deep Purple (GE Healthcare) (Bild erkannt 3). Interessanterweise führt Kang-Färbung Noten gut oder sogar besser (im Falle von Deep Purple) und ist daher auf jeden Fall überlegen in Bezug auf Arbeitseinsatz und Leistung!

Abbildung 3: Vergleich von Kang CBB-G250-based-Färbung (A) mit Sypro Ruby (B) und Deep Purple (GE Healthcare) (Abbildung 3). (C) Färbung der Proteinbanden in SDS-PAGE. Ein Molekulargewichtsmarker mit Phosphorylase b (97,4 kDa), BSA (66,2 kDa), Ovalbumin (45 kDa), Carboanhydrase (31 kDa), Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor (21,5 kDa) und Lysozym (14,4 kDa) wurde analysiert, mit Proteinmengen von 1 g / Band auf der linken Seite des Gels und fortlaufend verdünnt 2-fach nach rechts.

Trotzdem wurden diese Nachweisgrenzen mit Standard-Proteine ​​für Molekulargewichtsmarker verwendet und sollten mit Vorsicht betrachtet werden bestimmt. Aus diesem Grund haben wir zusätzlich geprüft Kangs Färbemethode mit verschiedenen Proteinen, die teilweise schwache Bindungsaffinität für CBB (zB Fetuin, mycin). Wie in Abbildung 4 zeigt, ist Kang-Protokoll über den üblichen CBB-Färbung und sogar eine bessere Leistung als Sypro Ruby, aber nicht kommen, bis zu Silberfärbung in diesem Fall. Wir glauben jedoch, Kang geändert Färbemethode ist eine hervorragende Alternative für empfindliche und schnelle Protein-Erkennungen in Gel-Basis Proteomik.

Abbildung 4: Protein-Färbung von Fetuin mit (A) kolloidale Coomassie Kang-Protokoll (ohne Entfärbung) im Vergleich zu (B) eine konventionelle CBB G-250 Färbung (40% Methanol und 10% Essigsäure), (C) Sypro Ryby und (D ) Silberfärbung nach Shevchenko et al. Protein Mengen von 2 g bis zu 2 ng verdünnt wurden für die SDS-PAGE geladen.

Focus II: Usability
Neben der verbesserten Nachweisgrenzen nicht Kangs Coomassie-Protokoll bieten zahlreiche Funktionen, die bevorzugte Richtung der Färbungen von Neuhoff oder Candiano und sogar Fluoreszenz-Protokolle macht:

• Fixierung und Färbung ist in einem Schritt
• nicht mehr als 4 Stufen in allen
• erste Färbung Ergebnisse sind schnell sichtbar (in den meisten Fällen innerhalb weniger als 20 Minuten)
• das Verfahren benötigt nur 2 Stunden für 80% Fertigstellung der Färbung
• nurminimal Hintergrundfärbung
• die Färbung ist sehr gut reproduzierbar (es ist ein Endpunkt-Methode)
• nicht mehr Umgang mit giftigen Alkohol (Methanol durch Ethanol ersetzt)
• Die Lösung ist fast geruchlos (keine Verwendung von Essigsäure)
• Einsatz von CBB G-250 in niedrigen Konzentrationen.

Zusammenfassend ist die Formel ganz bequem, relativ ungefährlich, umweltfreundlich und billig. Darüber Kang-Färbung ist vollständig kompatibel mit der Massenspektrometrie analysiert. Am Ende kann man sagen, dass Kang ist Coomassie-Färbung ist ausgezeichnet für eine schnelle und analytische In-Gel-Detektion von Proteinen, auch für die Proteomik Ansätze.

Materials

Immobiline DryStrip gels	GE Healthcare	17-6001-94	Can even be used 2 years after expire date.
Immobiline DryStrip Reswelling Tray	GE Healthcare	80-6371-84	Do not clean with organic solvents. Designed for 7-18 cm IPG-strips.
Immobiline DryStrip Kit	GE Healthcare	18-1004-30	Includes a tray, electrode holder, anode and cathode electrodes, aligner and sample cup bar and sample cups.
EPS 3501 XL Power Supply	GE Healthcare	18-1130-05	Supplies voltage up to 3500 V.
Multiphor II Electrophoresis Unit	GE Healthcare	18-1018-06	Movable electrodes enable IEF in IPG strips of all length (7-24 cm IPG strips)
PerfectBlue gel system Twin S	Peqlab	45-1010-C	SDS-PAGE in 10×10 cm mini-gel format. Gel chamber includes a cooling system.
staining dishes with lids	VWR international	216-3412	Fits for mini-gels. Stackable on shaker.
aluminium sulfate-18-hydrate	Merck & Co., Inc.	1.01102.5000	We made best experience with Merck. Just available in 5 kg package.
orthophosphoric acid	Prolabo	20 624.295	Sold in glass bottles.