Isolation und genetische Manipulation von Adult Herzmuskelzellen für konfokale Imaging

Zusammenfassung

Adult Herzmuskelzellen sind primäre Zellen, die aus tierischen Herzen isoliert und kultiviert für mehrere Tage. Innerhalb dieses Zeitraums Kultur adenoviralen Gentransfer können verwendet werden, um genetisch kodierte Biosensoren (GEBS) oder fluoreszierende Fusionsproteine ​​zu exprimieren. Beide Ansätze erlauben zellulären Untersuchungen mittels der konfokalen Mikroskopie.

Zusammenfassung

Herzmuskelzellen aus adulten Herzen isoliert werden weithin als ein Modell irgendwo auf halbem Weg zwischen embryonalen und neonatalen Muskelzellen auf der einen Seite und ein funktionierendes Herz auf der anderen akzeptiert. So dienen Kardiomyozyten als gute Modelle für kardiale zelluläre Physiologie und Pathophysiologie, für pharmazeutische Untersuchungen sowie für die Erforschung von transgenen Tiermodellen. Hier beschreiben wir eine Methode zur Isolierung von Zellen aus dem Herzen. Darüber hinaus zeigen wir, wie eine genetische Manipulation an Herzmuskelzellen ohne Zucht eines transgenen Tieres durchgeführt werden können: Dies ist die Kombination von langfristigen Kultur (1 Woche) und adenoviralen Gentransfer. Letzteres ist von der Konstruktion des Virus auf die Transduktion der Zellen beschrieben. Es kann für den Ausdruck von genetisch kodierten Biosensoren (GEBS), fluoreszierende Fusionsproteine ​​verwendet werden, sondern auch für die Protein-Überexpression und Down-Regulation, z. B. mittels RNAi. Hier bieten wir ein Beispiel für den Ausdruck eines Fusionsproteins Färbung eine subzelluläre Struktur (Golgi). Solche Protein-Expression kann durch konfokale Bildgebung von z-Stapeln visualisiert für eine 3D-Rekonstruktion von subzellulären Strukturen. Das Protokoll umfasst state-of-the-art in der Zellkultur, Molekularbiologie und Biophysik und bietet somit einen Ansatz zur Erforschung neuer Horizonte in der Zell-Kardiologie.

Protokoll

Die über alle Design des Protokolls enthält vier große Schritte ist in Abbildung 1 dargestellt. Alle Schritte werden ausführlich beschrieben. Zellisolierung, Transduktion und Kultur, durch konfokale Bildgebung etwa 24 Stunden später gefolgt ist ein konsekutiver und obligatorische Zeitskala. Das Virus Konstruktion sollte vor der Zelle isoliert durchgeführt werden und wird dann für die genetische Transduktion eingesetzt.

1. Isolation von adulten Herzmuskelzellen aus Ratten-Herzen

1. Erwachsene männliche Wistar-Ratten ca. 250 g Gewicht (6-12 Wochen alt) sind betäubt durch intraperitoneale Injektion von 170 ul Anästhesie-Lösung pro 10....

Diskussion

Das Verfahren zur Isolierung von Ratten-Kardiomyozyten beschrieben, kann auf andere Arten, wie zB Maus ⁴ angepasst werden, falls erforderlich. Ein Parameter, der Anpassung muss, ist die Enzym-Mix für die Verdauung (siehe unten) und auch die Dauer der Verdauung. Seien Sie sich bewusst, dass die Zellen einiger Arten (zB Maus) könnte noch zerbrechlicher als andere (zB Ratten).

Die Wahl der Kollagenase ist wahrscheinlich der wichtigste Schritt in der Isolierung. Wir wählen Liberase Bl.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Anästhesielösung	Serumwerk Bernburg GmbH (Ursotamin), Bayer Health Care (Rompun)		Mischung aus 1 ml Ursotamin (100 mg/ml Ketaminhydrochlorid) und 240 μl Rompun (2 % Xylazinhydrochlorid)
Citratlösung			117,64 mg Natriumcitrat in 10 ml 0,9 %iger NaCl-Lösung
Lösung A			134 mM NaCl, 4 mM KCl, 11 mM Glukose, 1,2 mM MgSO4, 1,2 mM Na2HPO4, 10 mM HEPES, pH mit 10 M NaOH auf 7,35 eingestellt, sterilfiltriert
Lösung A+			Inhalt der Lösung A zuzüglich 0,2 mM EGTA, pH mit 10 M NaOH auf 7,35 eingestellt, sterilfiltriert
Liberase-Lösung	F. Hoffmann‐ La Roche Ltd.	11988476 001	500 μl Stammlösung in 15 ml Lösung A (Stammlösung: 10 mg/ml Liberase Blendzyme 4 in Aqua dest.)
Lösung B			Inhalt der Lösung A zuzüglich 200 μM CaCl2 und 0,1 % DNase-Lösung
Lösung B1/2			1:1-Mischung aus Lösung A und Lösung B
DNase-Lösung	Sigma-Aldrich	D4527	Deoxyribonuklease I, Typ 2 aus Rinderpankreas, 40 KU (15 mg) werden in 5 ml 10 mM Tris‐HCl-Puffer gelöst, auf pH = 7,35 eingestellt, zusätzliche Inhaltsstoffe: 50 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 1 mM Dithi–rythritol; diese Lösung wird mit 5 ml Glycerin vermischt
Lösung für extrazelluläres Matrixprotein (ECM)	Lösung für extrazelluläres Matrixprotein (ECM)	E1270	1 ml Stammlösung, wie bezogen, wird mit 6 ml Medium M199 verdünnt
Kulturmedium M199	PAA Laboratories	E15‐834	Medium M199 ergänzt mit 1 μl/ml ITS-Lösung und 20 μl/ml Penicillin‐Streptomycin-Lösung (5000 Einheiten/ml)
ITS-Lösung			25 mg Insulin, 25 mg Transferrin und 50 μl Selenit-Stammlösung werden in 5 ml Aqua dest. gelöst (Stammlösung: 0,5 mg/ml Natriumselenit in Aqua dest.). Einige Tropfen 1 M HCl hinzufügen, bis eine klare Lösung entsteht. Aliquots können eingefroren werden.
Tyrode			135 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 1,8 mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 10 mM Glukose, 10 mM HEPES, pH mit 10 M NaOH auf 7,35 eingestellt, sterilfiltriert
Master-Mix			5 μl 10×PCR‐Buffer, 5 μl MgCl2 (25 mM), 2 μl Vorwärtsprimer, 2 μl Rückwärtsprimer, 1 μl dNTP´s (jeweils 10 mM), 33 μl H2O, 1 μl DMSO, 1 μl Taq‐DNA-Polymerase pro Probe
LB‐Medium			10 g/l Tryptone, 5 g/l Hefeextrakt, 5 g/l NaCl (und 15 g/l Agar, falls als festes Medium verwendet), pH 7,0
Pac I	New England Biolabs	R0547L	Zubereitung: 50 μg DNA, 5 μl 10×Buffer, 0,5 μl 100×BSA, 0,75 μl Pac I, mit H2O auf ein Endvolumen von 50 μl auffüllen