Denaturierung Urea Polyacrylamidgelelektrophorese (Urea PAGE)

Zusammenfassung

Denaturierung Harnstoff-Polyacrylamid-Gelelektrophorese wird verwendet, um Einzelstrang-DNA oder RNA getrennt bis zu einer Grenze von 500 Nukleotiden. Urea in Kombination mit Hitze denaturiert Proben und unstrukturierte Einzelstränge in der Gel-Matrix migrieren nach ihrem Molekulargewicht.

Zusammenfassung

Harnstoff-PAGE oder denaturierende Harnstoff-Polyacrylamid-Gelelektrophorese beschäftigt 6-8 M Harnstoff, der sekundären DNA-oder RNA-Strukturen denaturiert und wird für die Trennung in einem Polyacrylamid-Gel-Matrix auf das Molekulargewicht eingesetzt. Fragmente zwischen 2 bis 500 Basen, mit einer Länge von Differenzen so klein wie ein single nucleotide können getrennt mit dieser Methode ¹ sein. Die Migration der Probe ist abhängig von der gewählten Acrylamid-Konzentration. Ein höherer Prozentsatz von Polyacrylamid löst niedrigerem Molekulargewicht Fragmente. Die Kombination von Harnstoff und Temperaturen von 45-55 ° C während der Gel laufen zu lassen für die Trennung von unstrukturierten DNA-oder RNA-Moleküle.

Im allgemeinen wird diese Methode ist erforderlich, um zu analysieren oder zu reinigen Einzelstrang-DNA oder RNA-Fragmente, wie synthetisiert oder markierte Oligonukleotide oder Produkte aus der enzymatischen Spaltung Reaktionen.

In diesem Video-Artikel zeigen wir, wie die Vorbereitung und Ausführung der denaturierenden Harnstoff-Polyacrylamidgelen. Technische Tipps enthalten sind, zusätzlich zu den Original-Protokoll ^1,2.

Protokoll

Die vollständige und detaillierte Text-Protokoll für dieses experimentelle Vorgehen ist in Current Protocols in Molecular Biology. Detaillierte Schritt-für-Schritt-Anleitungen für die Montage des Gels Sandwich und für Gel-Apparatur kann auf der Website BioRad ³ gefunden werden.

Erforderliche Ausrüstung:
Glasplatten (innere und äußere)
10 cm-Zelle: 10,1 x 7,3 cm (Innen-Platte), 10,1 x 8,2 cm (äußere Platte), BioRad
20 cm-Zelle: 20 x 20 cm (innere Platte), 20 x 22,3 cm (äußere Platte), BioRad
0.5-1.5 mm Gel-Kamm und Spacer
Gel Gelgießstand
Gel Gerät mit Deckel und Kabel
Hochspannun....

Diskussion

1. Die Band Schärfe hängt von mehreren Faktoren ab. Das Volumen der Probe für scharfe Banden geladen werden sollte, so klein wie möglich, also im Idealfall zwischen 1-5 pl. Allerdings können bis zu 15 ul geladen, die noch eine akzeptable Auflösung. Weniger Probenvolumen Ergebnisse in schärfere Banden.
2. Die Band Qualität ist auch abhängig von der Gel-Dicke. Thinner Gelen, wie z. B. 0,75 mm zeigen bessere Ergebnisse als 1,5 mm dicken Gele.
3. Die Form der Bänder können auch während der Gel-loading beeinflusst werden, wenn di.......