Direkte Beobachtung von Enzymen Replizieren DNA Mit einem Single-Molekül DNA Stretching Assay

Summary

Wir beschreiben eine Methode zur Beobachtung der Echtzeit-Replikation einzelner DNA-Moleküle durch Proteine ​​des Bakteriophagen Replikationssystem vermittelt.

Abstract

Wir beschreiben eine Methode zur Beobachtung der Echtzeit-Replikation einzelner DNA-Moleküle durch Proteine ​​des Bakteriophagen Replikationssystem vermittelt. Linearisierte λ DNA wird modifiziert, um ein Biotin auf das Ende eines Stranges, und ein Digoxigenin-Rest am anderen Ende des gleichen Strang zu haben. Der biotinylierte Ende mit einem funktionalisierten Deckglas und die digoxigeninated Ende eine kleine Perle befestigt. Die Montage dieser DNA-Bead Anbindehaltung auf der Oberfläche einer Durchflusszelle ermöglicht eine Laminar-Flow anzuwenden, um eine Zugkraft auf dem Wulst auszuüben. Als Ergebnis wird die DNA in der Nähe und parallel zur Oberfläche des Deckglases mit einer Kraft, die durch den Durchfluss (Abbildung 1) bestimmt wird gestreckt. Die Länge der DNA wird durch die Überwachung der Position der Perle gemessen. Länge Unterschiede zwischen Einzel-und Doppelstrang-DNA werden genutzt, um in Echtzeit Informationen über die Tätigkeit der Replikation Proteine ​​an der Gabelung zu erhalten. Die Messung der Position der Sicke ermöglicht eine präzise Bestimmung der Preise und processivities von DNA Abwickeln und Polymerisation (Abbildung 2).

Protocol

1. DNA Replication Vorlage

DNA für die Reaktion ist ein linearisierter λ-DNA durch Glühen von Oligonukleotiden zu einer Replikationsgabel Form modifiziert. Darüber hinaus ist Biotin an das Ende eines Stranges der λ DNA befestigt, und ein Digoxigenin-Rest ist an das andere Ende des gleichen Strang ¹ beigefügt.

Werkstoffe: Bakteriophagen λ DNA, Oligonukleotide: biotinylierten Gabelarm (A: 5'-Biotin-AAAAAAAAAAAAAAAAGAGTACTGTACGATCTAGCATCAATCACAGGGTCAGGTTCGTTATTGTCCAACTTGCTGTCC-3 '), λ-komplementäre Gabelarm (B: 5'-GGGCGGCGACCTGGACAGCAAGTTG GACAATCTCGTTCTATCACTAATTCACTAATGCAGGGAGGATTTCAGA....

Discussion

Es ist wichtig, um sicherzustellen, dass die Zugkraft auf Kügelchen von Laminar-Flow ausgeübt hat keinen Einfluss auf enzymatische Aktivitäten der Replikation Proteine. Zum Beispiel hat ein 3 pN Kraft, die zu einem Durchfluss von 0,012 ml / min entspricht nicht berührt Replikation der DNA-Strang führt. Es hat jedoch Auswirkungen auf enzymatische Aktivitäten, die während koordiniert die DNA-Synthese, und es muss daher auf 1,5 pN reduziert werden. Die Zugkraft kann durch Änderung der Strömungsgeschwindigkeit oder eine Bre.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bakteriophagen λ DNA	New England Biolabs	N3011L
DNA-Oligonukleotide	Integrierte DNA-Technologien
T4-DNA-Ligase	New England Biolabs	M0202L
T4-Polynukleotidkinase	New England Biolabs	M0201L
α-Digoxigenin Fab	Roche Group	11214667001
Tosyl-aktivierte Kügelchen	Invitrogen	142-03
Magnetabscheider	Invitrogen	Dynal MPC
3-Aminopropyl-triethoxysilan	Sigma-Aldrich	A3648	Andere Aminosilane können verwendet oder mit nicht-aminreaktiven Silanen für dünnere Oberflächen gemischt werden
Succinimidylpropionat PEG	Nektar		Ähnliche PEGs können von Nanocs, CreativePEGWorks, etc. erworben werden.
Biotin-PEG-NHS	Nektar		Ähnliche PEGs können von Nanocs, CreativePEGWorks, etc. erworben werden.
Doppelseitiges Klebeband	Grace Bio-Lab Inc.	SA-S-1L	100 μ m Dicke
Quarzschiene	Technisches Glas	20 mm (B)x 50 mm (L)x 1mm (H)	Größe passend für Deckgläser. Bohrungen mit Diamantbohrern (DiamondBurs.net)
Polyethylenschlauch	BD Biosciences	427416	0,76 mm ID, 1,22 OD Rohre anderer Größen können ersetzt werden.
Streptavidin	Sigma-Aldrich	S4762	Herstellung einer Lösung von 1 mg/ml, 25 μ L-Aliquote in PBS pH 7,3
Desoxyribonukleotid-Triphosphat-Lösungsmix	New England Biolabs	N0447
Inverses optisches Mikroskop mit 10-fachem Objektiv	Olympus Corporation	Olympus IX-51
Permament Seltenerdmagnet	Nationale Importe	www.rare-earth-magnets.com
CCD-Kamera	QImaging	Rolera-XR Fast 139
Spritzenpumpe	Harvard Apparatus	11 Plus	Betrieb im Nachfüllmodus, um Lösungswechsel zu erleichtern
Fiber Illuminator	Thorlabs Inc.	OSL1