In diesem Video zeigen wir, das Verfahren der CD40-Aktivierung und Expansion von murinen B-Zellen aus Splenozyten von C57BL / 6 Mäusen, die als Modell-Antigen-präsentierende Zellen (APC) zur Induktion der Immunität Studie verwendet werden können.
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Methodenartikel
Mausmodell der CD40-Aktivierung von B-Zellen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Forschung auf B-Zellen haben gezeigt, dass CD40-Aktivierung ihrer Antigen-Präsentation Kapazität verbessert. Wenn mit Interleukin-4 und CD40-Ligand (CD40L) stimuliert, kann das menschliche B-Zellen ohne Schwierigkeiten von kleinen Mengen von peripheren Blut innerhalb von 14 Tagen bis sehr große Mengen an hochreinen CD40-B-Zellen (erweiterbar> 10
Protokoll
Das Protokoll für die Erzeugung von Maus-CD40-aktivierten B-Zellen (mCD40B) von Splenozyten ist in zwei Teile gegliedert: Teil A zeigt die Herstellung von Maus-CD40-Ligand (CD40L) exprimierende HeLa-Zellen (tmuCD40L HeLa), die als verwendet werden Platten- Feeder-Zellen gebunden. Teil B beschreibt die eigentliche murine CD40-B Kultur.
A. Herstellung von Feeder-Zellen (tmuCD40L HeLa)
Die tmuCD40L HeLa ist ein Anhänger menschlichen epithelialen Zell-Linie, die nie sollte vollständig konfluent. Die Zellen sind daher zweimal pro Woche aufgeteilt. Die Kultivierung von mehr als 6 Wochen wird nicht empfohlen.
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Diskussion
Änderungen dieses Protokolls sind möglich, insbesondere über die Herkunft der CD40-Stimulus und die Art der Maus-Stamm verwendet, auch Nachgeben in effiziente Erzeugung von Maus-CD40-aktivierten B-Zellen. Ahmadi et al. haben gezeigt, ähnliche Ergebnisse für Maus-Fibroblasten mit murinen CD40-Ligand transfiziert. In diesem Zusammenhang Präsentation der Xeno-Antigen kann mit Sicherheit ausgeschlossen werden, aber intensive Studien hinsichtlich Sicherheit und Toxizität in vivo gab keine Anzeichen für eine Entzündu.......
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Offenlegungen
Die Experimente wurden in Übereinstimmung mit den nationalen und europäischen Richtlinien für Labor Tierhaltung durchgeführt. Unter Bezugnahme des deutschen Tierschutzgesetz wurden die Tiere regelmäßig von den zuständigen Behörden kontrolliert.
Danksagungen
Wir danken Dr. Clemens Wendtner für die Bereitstellung tmuCD40-Ligand-HeLa-Zelllinie.
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Materialien
A. Herstellung der Medien:
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Feeder Zelle Wildtyp-Medium | Feeder Zelle Selektionsmedium | ||
| Reagens | Konzentration | Reagens | Konzentration |
| RPMI 1640 | RPMI 1640 | ||
| L-Glutamin | 300 ug / mL | L-Glutamin | 300 ug / mL |
| FBS | 10% | FBS | 10% |
| HEPES | 10 mM | HEPES | 10 mM |
| Gentamycin | 15 ug / mL | Gentamycin | 15 ug / mL |
| Hygromycin B | 0,2 mg / mL |
| mCD40-B Waschmedium | mCD40-B Kulturmedium | ||
|---|---|---|---|
| Reagens | Konzentration | Reagens | Konzentration |
| D-MEM | D-MEM | ||
| L-Glutamin | 580 pg / mL | L-Glutamin | 580 pg / mL |
| Glucose | 4,5 mg / mL | Glucose | 4,5 mg / mL |
| HEPES | 10 mM | HEPES | 10 mM |
| Gentamycin | 15 ug / mL | Gentamycin | 15 ug / mL |
| MEM | 0,1 mm (1x) | ||
| FBS | 10% |
B. Sonstige Reagenzien:
| Reagens | Firma | Bestell-Nr |
| RPMI 1640 | Invitrogen Gibco | REF 21875 |
| D-MEM | Invitrogen Gibco | REF 41965 |
| Dulbeccos PBS (10x) | PAA | Cat No H15-011 |
| Gencin | Delta Select | Art.-Nr. 7395800 |
| FBS | LONZA | Cat No DE14-802C |
| HEPES-Puffer | PAA | Cat No S11-001 |
| MEM NEAA | Invitrogen Gibco | REF 11140 |
| Hygromycin B | PAA | Cat No P02-015 |
| Recombinant Murine Interleukin-4 | Immunotools | Cat No 12340045 |
| Cyclosporin A | Novartis | Cat No NDC 0078-0109-01 |
| Trypsin / EDTA (10x) | Invitrogen Gibco | REF 15400-054 |
C. Sonstiges Zubehör:
| Reagens | Firma | Bestell-Nr |
|---|---|---|
| Sterile Pipettenspitzen | Sarstedt | |
| 6-Well-Platte | NUNC | Cat No 140675 |
| 50 ml konischen Rohr | BD Falcon ™ | Cat No 352070 |
| Zellkulturflasche | Sarstedt | Cat No 83.1813.002 |
Referenzen
- Schultze, J. L. CD40-activated human B cells: an alternative source of highly efficient antigen presenting cells to generate autologous antigen-specific T cells for adoptive immunotherapy. J Clin Invest. 100 (11), 2757-2765 (1997).
- Wiesner, M.
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Nachdrucke und Genehmigungen
