Summary
这个协议描述为上皮细胞和细菌的同时，本地化的文化的微流体的共培养模型。该模型可用于调查发病机制不同的可溶性的分子信号的作用，以及屏幕上公认的益生菌株细菌的效力。
Abstract
人体胃肠道（GI）是一个独特的环境中肠上皮细胞和非致病性细菌（共生）共存。有人曾提出，微环境中的病原体在共生层遇到，在确定殖民化的程度是很重要的。调查病原菌定植目前文化特性的方法是不适合负责调查这一假说，因为他们不模仿胃肠道微环境的方式，使细菌细胞和上皮细胞的共培养。在这里，我们描述了一个微流体的共培养模型，使真核细胞和细菌的独立的文化和测试病原菌定植共生的微环境的影响。共培养模型，证明了开发一个共生
Protocol
1。制备硅的主人，使用标准的SU - 8光刻1（在这个视频没有显示）。
- 使用标准的SU - 8的光刻方法来创建一个SU - 8的“主人”（SU - 8月到2050年，MicroChem，牛顿，MA）在洁净室中制造不同的组件（不同厚度的PDMS膜，合作文化室）。这种掌握模具，可以制作任何微细加工设施（例如，斯坦福大学的微流体铸造; http://thebigone.stanford.edu/foundry/） 。
- 的PDMS复制之前，公开的SU - 8的主人fluorosilane蒸汽，在连接到真空源，以方便从主PDMS容易释放干燥器 。添加fluorosilane下降到纸巾，并申请一分钟的真空。拆下真空，并允许30分钟fluorosilane沉积。存放在密闭容器中以备将来使用SU - 8的主。
2。 PDMS 2主从SU - 8的副本成型
- 流体层和控制层是由硅橡胶成型的SU - 8主副本。
- 10:1 WT混合的PDMS预聚物和交联剂。比和德加在1小时（或直到气泡从PDMS的混合物中删除）的干燥器。
- 放置在培养皿SU - 8的主，并仔细的SU - 8的掌握上的PDMS混合物倒入。德加再次在PDMS的。
- 在1200转每分钟一分钟的旋转模具，模具厚度约100μm的一个统一的PDMS。
- 热培养皿中包含一个小时的PDMS和SU - 8母模，在80 ° C固化的PDMS。
- 取出固化硅橡胶覆盖的电磁炉SU - 8的主。
- 去皮，从SU - 8的主的PDMS模具。
- 在PDMS模具钻四个孔，使用20号钝针两种细菌的入口，一个出口和一个气动接口。
3。粘接多层PDMS设备：该设备是组装三个层次的顶层，其中包含的主渠道，中间气动层，和自下而上的细菌层，包含细菌的渠道。三层组装如下所述。
- 湿的PDMS膜用甲醇和仔细剥离他们从SU - 8的主使用一个干净的镊子模具。将膜在聚四氟乙烯薄片。
- 将气动薄膜氧离子室和流体层。打开血浆为40秒（氧压10 SCCM，射频功率100W）。
- 曝光后的血浆中，对齐（10分钟内）使用镊子在底部的PDMS通道的膜。膜与硅橡胶层上添加甲醇，有利于自由流动层，使校准更容易。在这种情况下，设备被放置在一块纱布，使甲醇蒸气逃脱。
- 对齐的PDMS层固化在80℃的烤盘上8小时
- 到底层的气动薄膜粘合后，重复步骤3.2 - 3.4债券到组装复合硅橡胶设备顶级渠道。
4。组装的PDMS设备3,4
- 孔钻在播种真核细胞和细菌所使用的进口和出口。
- 聚乙烯管（0.01英寸外径）连接的端口和操作气动层，用20ml注射器拉。
- 广场的PDMS模型和预清洁的玻片上一个成一个氧离子室。血浆转20秒（氧气压力为20 SCCM，射频功率300W）不应用真空。
- 为了防止岛内墙（PDMS）粘接到玻璃幻灯片之间的接触，立即注射器连接到设备，适用于真空拉动注射器和到位。
- 轻轻地按在玻璃上的PDMS模型（在2分钟内）。
- 固化的PDMS设备在80 ° C为10分钟。
5。玻璃表面与纤维连接蛋白治疗
- 在紫外光下消毒15分钟后，聚乙烯管连接到每一个端口的设备。
- 填充和流入的渠道灭菌的PBS的通道，以消除任何碎片。应用流量为10分钟，以去除气泡。气泡可以很容易地逃脱的PDMS由于其气体渗透。
- 气动通道，以防止气泡形成的通道进入一个填充色染料溶液。
- 为了方便在玻璃上的真核细胞播种，引入设备的纤维连接蛋白1μg/ mL的溶液，孵育40分钟，在37 ° C。
- 1毫升培养基洗净多余的纤维连接蛋白。
6。共生的大肠杆菌的形成和测量大肠杆菌生物膜IN群岛
- 淡化M9基本媒体的共生细菌（ 如大肠杆菌BW25113/pCM18） 外径 600〜1形成一个封闭商会/离岛的共生生物膜。
- 关闭岛内墙应用正液体压力。一个自制的空气，液体压力转换器是用来防止空气泡沫形成的通道。
- 引进共生的大肠杆菌与阀岛的大肠杆菌封闭，并且使细菌附加1小时32 ° C 。
- 洗净独立的细菌和灌注在12小时0.25mL/hr稀释的菌悬液（外径600〜0.05）。
- 冲洗用新鲜的DMEM培养液生长介质的生物膜去除松散附着的细菌和真核细胞附着的准备。
- 图片生物膜，使用了Leica TCS SP5共聚焦激光扫描显微镜（班诺克本，IL），和可视化生物膜结构，使用IMARIS软件5。
7。播种真核细胞周围的细菌群岛6-8
- Trypsinize接种密度为5 × 10 5细胞/ mL HeLa细胞组织培养瓶和媒体的DMEM悬浮。
- 在流速2 mL / min的使用Picoplus注射泵（Apparattus哈佛大学，马萨诸塞）引进设备的HeLa细胞。确保岛内墙降低，使细菌生物膜从HeLa细胞的区域是分开的。这一步应该是执行上的光学显微镜的阶段，使播种均匀，可确定。
- 夹紧单元插座，以减少渠道和孵育6 h后，在37 ° C，5％二氧化碳培养箱运动的细胞悬液。
- 灌注0.5毫升/小时的设备删除独立的细胞生长介质。
- 刷新HeLa和共生的大肠杆菌的DMEM媒体大肠杆菌每6小时。
8。进岛和接触到真核细胞的致病菌简介
- 准备E。大肠杆菌 O157：H7型（肠出血性大肠杆菌）感染HeLa细胞的感染复数（MOI）为100:1 200:1（每HeLa细胞的肠出血性大肠杆菌的数量） 。
- 冲洗和洗出松散连接的共生细菌。
- 引入岛屿稀肠出血性大肠杆菌悬液（外径600〜0.1）。
- 在37 ° C至5％的CO 2培养箱中培养6小时无流使肠出血性大肠杆菌暴露于共生生物膜中存在的信号的设备。
- 电梯的PDMS墙暴露在共生岛屿6个小时的HeLa细胞的肠出血性大肠杆菌。
- 用PBS冲洗通道，并使用活/死的试剂盒（L3224，Invitrogen公司，加利福尼亚州）的活的和死的细胞染色。
- 在ZEISS AXIOVERT 200M荧光显微镜和图像的多个地点，估计活的和死细胞的数量。
9。代表性的成果9
消化道感染的事件的顺序是模仿开发的HeLa细胞单层和共生的大肠杆菌大肠杆菌生物膜和揭露肠出血性大肠杆菌的共生生物膜感染的HeLa细胞之前。制造微流体的共培养模型中所涉及的步骤如图1所示，图2a显示了一个共同的文化设备的三维渲染。在这两个地区共同培养装置的真核细胞培养室和细菌岛屿如图2b所示，用不同颜色的染料（真核细菌岛地区和绿色紫色）。显示在图2C使用彩色染料的细菌培养地区隔离开来的真核周围地区的可行性。图3显示了有代表性的结果，从上皮细胞和细菌共同培养，图3a所示的共生生物膜（绿色）岛的殖民统治肠出血性大肠杆菌（红色） 图3b显示并列的上皮细胞和共生的大肠杆菌与肠出血性大肠杆菌大肠杆菌的细菌岛。肠出血性大肠杆菌和绿色荧光蛋白表达的共生细菌的表达RFP的本地化中的PDMS墙降低时的岛屿，说明上皮细胞的分离细菌岛可行性。
图1：细胞共培养模型的播种计划。 （1）降低的PDMS墙形成一个岛屿，共生细菌引入岛内，和纤维连接蛋白是环岛流。 （2）HeLa细胞接种在岛屿四周的地区。 （3）在HeLa细胞达到汇合和已开发的共生生物膜，肠出血性大肠杆菌引入岛内。 （4）取消的PDMS墙揭露HeLa细胞周围的岛屿，以肠出血性大肠杆菌。插图显示阀门操作细节。
图2：微流控模型的上皮细胞和细菌共同培养 。 （一）立体移交逃犯的合作文化诱捕地区的气动驱动装置上皮细胞之间形成的细菌群岛。每个细菌的岛屿（1200微米直径，除了1000微米）提供生长介质，并消除浪费从岛上有一个单独的入口和出口。 （二）显微设备的颜色显示不同地区的染料（区上皮细胞，细菌群岛）共同培养。 （三）气动诱捕系统的保真度降低墙上的PDMS（左侧面板）使用气动激活通道（蓝色），紫色染料引入封闭岛群岛，和它周围的黄染48小时流动当PDMS的墙（右图）提出，岛屿地区是暴露在周围的黄色染料。比例尺代表500微米。
图3：HeLa细胞和细菌共培养 。 （一）荧光图像RFP的表达肠出血性大肠杆菌和GFP表达大肠杆菌在岛的大肠杆菌BW25113 。 （二）的传输覆盖，绿色，和红色荧光图像设备。比例尺代表200微米。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
病原体附着和殖民化的常规检测，利用单层培养板中的真核细胞添加到其中的病原体。这些模型不是生理有关，因为他们没有纳入一个真核细胞共生细菌生物膜开发。预先生长的细菌培养的简单相加，真核细胞是不大可能导致这种构象，作为生物膜是高度的组织结构，随着时间的推移发展，是非常困难的，如果没有几乎是不可能的的，在细菌的存在真核细胞中的文化长时间没有生存能力的重大损失。由于病原体不通过这些模型的共生生物膜导航附加到上皮细胞，这些模型并不精确地模仿了消化道的上皮细胞和共生细菌组织。在这里，我们勾勒出一个微流体装置，使用气动控制诱捕的真核细胞和细菌的共同文化的发展。我们使用的HeLa细胞，真核细胞模型线和肠出血性大肠杆菌作为模型病原体显示，共培养装置可以保持岛屿地区以及隔离支持培育和发展了HeLa细胞单层和一个共生的大肠杆菌大肠杆菌生物膜。微流体的共培养模式不仅使共生菌和上皮细胞的本地化，而且前公开共生细菌病原体之前遇到上皮细胞，从而，在定植提出一个有关生理环境。此外，共培养模型可以是一个有用的工具，重点调查肠出血性大肠杆菌感染性以及潜在的益生菌菌株筛选等应用的特定信号的作用的基础研究。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
这项工作是支持部分由美国国家科学基金会（CBET 0846453）和美国国立卫生研究院（1R01GM089999）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SU-8 2050 | MicroChem Corp. | ||
| high-resolution (16,256 dpi) photolithography mask | Fineline-Imaging Inc, CO | ||
| Trichloro(3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8-tridecafluorooctyl)silane | Sigma-Aldrich | 77279 | |
| PDMS | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH30002.02 | |
| Programmable spin coater | Laurell Tech Corp | WS0650S | |
| Mask aligner | Neurotronix | Q4000 | |
| Oxygen plasma etcher | March Plasma System, CA | CS-1701 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | ||
| Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit | Invitrogen | L-3224 |
References
- McDonald, J. C. Prototyping of microfluidic devices in poly(dimethylsiloxane) using solid-object printing. Anal Chem. 74, 1537-1545 (2002).
- Jeon, N. L. Design and fabrication of integrated passive valves and pumps for flexible polymer 3-dimensional microfluidic systems. Biomed Microdevices. 4, 117-121 (2002).
- Baek, J. Y., Park, J. Y., Ju, J. I., Lee, T. S., Lee, S. H. A pneumatically controllable flexible and polymeric microfluidic valve fabricated via in situ development. J Micromech Microeng. 15, 1015-1020 (2005).
- Grover, W. H., Ivester, R. H., Jensen, E. C., Mathies, R. A., A, R. Development and multiplexed control of latching pneumatic valves using microfluidic logical structures. Lab Chip. 6, 623-631 (2006).
- Lee, J., Jayaraman, A., Wood, T. K., K, T. Indole is an inter-species biofilm signal mediated by SdiA. BMC Microbiol. 7, 42-42 (2007).
- Hsu, C. H., Folch, A. Microfluidic devices with tunable topographies. Appl Phys Lett. 86, 023508-023508 (2005).
- Hui, E. E., Bhatia, S. N.
- Lee, J. Y. Integrating sensing hydrogel microstructures into micropatterned hepatocellular cocultures. Langmuir. 25, 3880-3886 (2009).
- Kim, J., Hegde, M., Jayaraman, A. Co-culture of epithelial cells and bacteria for investigating host-pathogen interactions. Lab-on-Chip. , (2009).
