Summary
يصف هذا البروتوكول ميكروفلويديك شارك في ثقافة نموذج للثقافة في وقت واحد ومترجم من الخلايا الظهارية والبكتيريا. ويمكن استخدام هذا النموذج للتحقيق في دور الاشارات الجزيئية للذوبان في مختلف المرضية فضلا عن الشاشة فعالية من السلالات البكتيرية بروبيوتيك المفترضة.
Abstract
الإنسان الجهاز الهضمي (غي) المسالك هي بيئة فريدة من نوعها في الخلايا الظهارية التي المعوية وغير الممرضة - (المتعايشة) البكتيريا تتعايش. وقد اقترح أن المكروية أن واجه الممرض في طبقة المتعايشة مهم في تحديد مدى الاستعمار. الثقافة ليست الأساليب الحالية لتحقيق الاستعمار الممرض مناسب تماما عن التحقيق في هذه الفرضية لأنها لا تشارك في تمكين الثقافة من البكتيريا والخلايا الظهارية في بأسلوب يحاكي المكروية الجهاز الهضمي. نحن هنا وصف ميكروفلويديك شارك في ثقافة نموذج تمكن ثقافة مستقلة من الخلايا حقيقية النواة والبكتيريا ، واختبار تأثير الاستعمار المكروية المتعايشة على الممرض. ويتجلى النموذج المشترك من خلال تطوير ثقافة المتعايشة
Protocol
1. تصنيع السيليكون سادة باستخدام معيار SU - 8 ضوئيه 1 (لا يظهر في هذا الفيديو).
- استخدام الأساليب القياسية SU - 8 ضوئيه لإنشاء SU - 8 "سادة" (SU - 8 2050 ، MicroChem ، نيوتن ، MA) لانتاج مكونات مختلفة (سمك الأغشية PDMS مختلفة ، وشارك في ثقافة الغرفة) في غرف الأبحاث. يمكن أن تكون ملفقة قوالب الرئيسي من هذا القبيل في أي مرفق التصنيع الدقيق (على سبيل المثال ، على microfluidics مسبك ستانفورد ؛ http://thebigone.stanford.edu/foundry/ ).
- قبل PDMS النسخ المتماثل ، فضح SU - 8 سادة لبخار fluorosilane في مجفف تعلق بمصدر فراغ لتسهيل إطلاق سراح من السهل PDMS من سيد أضف قطرة من fluorosilane على منشفة ورقية وتطبيق فراغ لمدة دقيقة. إزالة فراغا ويسمح لمدة 30 دقيقة لترسب fluorosilane. الحفاظ على SU - 8 الماجستير في حاوية مغلقة لاستخدامها في المستقبل.
2. صب متماثلة PDMS من SU - 8 2 ماستر
- مصنوعة طبقة وطبقة fluidic سيطرة صب متماثلة PDMS من SU - 8 الرئيسي.
- مزيج PDMS قبل البوليمر وعبر رابط ، على وزن 10:01. النسبة وديغا في مجفف لل1hour (أو حتى تتم إزالة فقاعات الهواء من خليط PDMS).
- ضع SU - 8 الماجستير في طبق بتري ويسكب الخليط بعناية PDMS على رأس سيد SU - 8. ديغا في PDMS مرة أخرى.
- تدور في 1200 دورة في الدقيقة العفن لدقيقة واحدة للحصول على سمك PDMS موحد حول 100μm على العفن.
- تسخين طبق بتري الذي يحتوي على PDMS وSU - 8 القالب الرئيسي عند 80 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة لعلاج PDMS.
- إزالة الشفاء PDMS المغطاة SU - 8 الرئيسية من موقد.
- قشر العفن PDMS من سيد SU - 8.
- حفر أربعة ثقوب في القالب PDMS باستخدام قياس 20 إبرة حادة في نهاية البكتيريا لمداخل اثنين ، واحد ومخرج منفذ واحد الهوائية.
3. الرابطة من الأجهزة متعددة الطبقات PDMS : يتم تجميع هذا الجهاز مع ثلاث طبقات ، الطبقة العليا التي تحتوي على القناة الرئيسية ، طبقة الهوائية المتوسطة ، والطبقة السفلية البكتيرية التي تحتوي على قنوات للبكتيريا. يتم تجميعها في ثلاث طبقات على النحو المبين أدناه.
- الرطب الأغشية PDMS مع الميثانول وبعناية من قشر لهم بهم SU - 8 القالب الرئيسي باستخدام الملقط نظيفة. غشاء مكان على ورقة تفلون.
- مكان الغشاء الهوائية وطبقة fluidic على الأوكسجين غرفة البلازما. بدوره على البلازما لمدة 40 ثانية (10 SCCM ضغط الأكسجين طاقة ترددات الراديو RF 100W).
- بعد التعرض للالبلازما ، محاذاة (في غضون 10 دقيقة) الغشاء على قناة PDMS القاع باستخدام ملقط. مضيفا الميثانول على الغشاء وطبقات PDMS يساعد الحركة الحرة للطبقات ، ويجعل المحاذاة أسهل. في هذه الحالة ، يتم وضع الجهاز على قطعة من الشاش للسماح للأبخرة ميثانول من الفرار.
- علاج PDMS طبقات الانحياز على موقد في 80 درجة مئوية لمدة 8 ساعة.
- بعد الترابط الغشاء الهوائية على الطبقة السفلية ، كرر الخطوات من 3،2-3،4 لسندات القناة أعلى على الجهاز المركب PDMS تجميعها.
4. تجميع الجهاز PDMS 3،4
- حفر ثقوب في الموانئ مدخل ومخرج تستخدم لبذر خلايا حقيقية النواة والبكتيريا.
- توصيل أنابيب Tygon (0.01 بوصة OD) إلى الموانئ وتشغيلها عن طريق سحب الطبقة الهوائية مع حقنة 20mL.
- وضع نموذج PDMS وشريحة زجاجية قبل تنظيفها الى غرفة الأوكسجين البلازما. بدوره على البلازما لمدة 20 ثانية (20 SCCM ضغط الأكسجين طاقة ترددات الراديو RF 300W) من دون تطبيق هذا الفراغ.
- وذلك لمنع الاتصال بين الرابطة الجزيرة (PDMS) الجدار إلى الشريحة الزجاجية ، الاتصال فورا حقنة إلى الجهاز وتطبيق الفراغ عن طريق سحب المحقنة وعقد في مكانه.
- اضغط برفق نموذج PDMS على الزجاج (في حدود 2 دقيقة).
- علاج الجهاز PDMS في 80 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
5. معالجة السطح الزجاجي مع فبرونيكتين
- تعقيم الجهاز تحت الأشعة فوق البنفسجية لمدة 15 دقيقة بعد توصيل أنابيب Tygon إلى كل منفذ.
- التعبئة وتدفق PBS تعقيمها في قناة لإزالة أي حطام في القناة. تطبيق تدفق لمدة 10 دقائق لإزالة فقاعات الهواء. يمكن لفقاعات الهواء الهرب بسهولة PDMS بسبب نفاذية الغاز.
- ملء محلول الصبغة اللون في القناة الهوائية لمنع تشكيل فقاعات الهواء في القناة.
- لتسهيل خلية حقيقية النواة البذر على الزجاج ، وإدخال 1 ميكروغرام / مل حل فبرونيكتين في الجهاز ، واحتضان لمدة 40 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
- غسل فبرونيكتين الزائدة مع 1 مل من وسائط النمو.
6. تشكيل وقياس هاء المتعايشة بيوفيلم في القولونيةالجزر
- تمييع البكتيريا المتعايشة (على سبيل المثال ، كولاي BW25113/pCM18) في وسائل الإعلام إلى الحد الأدنى من M9 OD 600 ~ 1 لتشكيل بيوفيلم المتعايشة في الغرف المغلقة / الجزر.
- إغلاق الجدار الجزيرة إيجابية من خلال تطبيق ضغط السائل. ويستخدم محلية الصنع تحويل ضغط الهواء إلى سائل لمنع تشكيل فقاعة الهواء في القناة.
- أعرض E. المتعايشة مغلق القولونية في الجزر مع صمام ، وتسمح للبكتيريا ان نعلق لمدة 1 ساعة على 32 درجة مئوية.
- غسل البكتيريا غير مرتبط ويروي تعليق تمييع البكتيرية (OD 600 ~ 0.05) في 0.25mL/hr لمدة 12 ساعة.
- شطف بيوفيلم مع الطازجة وسائط النمو DMEM لإزالة البكتيريا فضفاضة المرفقة والاستعداد للارتباط الخلية حقيقية النواة.
- صورة بيوفيلم باستخدام TCS SP5 ايكا مسح بالليزر متحد البؤر مجهر (بانوكبورن ، IL) ، ووضع تصور لهيكل بيوفيلم باستخدام برنامج IMARIS 5.
7. بذر خلايا حقيقية النواة حول الجزر البكتيرية 6-8
- يعرض للتريبسين خلايا هيلا من قارورة زراعة الأنسجة وresuspend في وسائل الإعلام عن كثافة DMEM بذر خلايا من 5 × 5 10 / مل.
- إدخال خلايا هيلا في الجهاز بمعدل تدفق 2 مل / دقيقة باستخدام مضخة محقنة Picoplus (هارفارد Apparattus ، MA). ضمان أن يتم تخفيض الجدار الجزيرة بحيث بيوفيلم البكتيرية منفصل عن المنطقة الخلية هيلا. يجب أن يتم تنفيذ هذه الخطوة على مرحلة مجهر الضوء بحيث يمكن تحديد توحيد البذر.
- المشبك مأخذ خلية للحد من حركة تعليق خلية في القناة واحتضان لمدة 6 ساعات إلى 37 درجة مئوية في حاضنة 5 ٪ CO 2.
- يروي الجهاز مع نمو المتوسط عند 0.5 مل / ساعة لإزالة الخلايا غير مرتبط.
- تحديث وسائل الإعلام عن DMEM هيلا وهاء المتعايشة القولونية كل 6 ساعات.
8. مقدمة من البكتيريا المسببة للأمراض في الجزيرة ، والتعرض للخلايا حقيقية النواة
- إعداد E. القولونية O157 : H7 (EHEC) لتصيب خلايا هيلا في عدد وافر من العدوى (موي) من 100:1 200:1 (عدد EHEC لكل خلية هيلا).
- شطف وغسل البكتيريا المتعايشة فضفاضة المرفقة.
- أعرض تعليق تمييع EHEC (OD 600 ~ 0.1) في الجزر.
- احتضان الجهاز عند 37 درجة مئوية في حاضنة 5 ٪ CO 2 لمدة 6 ساعات دون تدفق للسماح EHEC أن تتعرض لإشارات موجودة في بيوفيلم المتعايشة.
- رفع الجدار PDMS لفضح EHEC المتعايشة في الجزر إلى خلايا هيلا لمدة 6 ساعات.
- شطف مع قناة PBS وصمة عار للخلايا الحية والميتة استخدام عدة لايف / الميت (L3224 ، Invitrogen ، CA).
- مواقع متعددة على صورة مجهر زايس 200M Axiovert مضان وتقدير عدد الخلايا الحية والميتة.
9. نتائج ممثل 9
وحاكت تسلسل الأحداث في التهابات الجهاز الهضمي من خلال تطوير أحادي الطبقة من الخلايا هيلا والمتعايشة E. بيوفيلم القولونية وفضح EHEC إلى بيوفيلم المتعايشة قبل إصابة خلايا هيلا. تظهر الخطوات المتبعة في تصنيع نموذج التعاون ثقافة ميكروفلويديك في الشكل 1. 2A الشكل يظهر تقديم 3 الابعاد للجهاز المشترك الثقافة. وترد المنطقتين في الجهاز المشترك ثقافة ثقافة خلية حقيقية النواة غرفة وجزيرة الجرثومي في الشكل 2B بأصباغ مختلفة الألوان (اللون الأرجواني للمناطق خضراء وحقيقية النواة للجزيرة الجرثومي). يظهر جدوى عزل مناطق ثقافة البكتيرية من المنطقة المحيطة حقيقية النواة في الشكل 2C باستخدام الأصباغ الملونة. ويبين الشكل 3 ممثل من نتائج ثقافة مشتركة من الخلايا الظهارية والبكتيريا. 3A يبين الشكل استعمار بيوفيلم المتعايشة (الخضراء) الجزيرة EHEC (الحمراء). الشكل 3B يبين تجاور الخلايا الظهارية وهاء المتعايشة القولونية مع EHEC في الجزيرة البكتيرية. وطلب تقديم العروض المترجمة معربا عن EHEC والبكتيريا المتعايشة معربا عن GFP في الجزيرة عندما ينخفض الجدار PDMS ، مما يدل على جدوى عزل الجزيرة بكتيرية من الخلايا الظهارية.
الشكل 1 : مخطط الخلية البذر في نموذج التعاون الثقافة. (1) ينخفض الجدار PDMS على شكل جزيرة ، وقدم البكتيريا المتعايشة في الجزيرة ، وتدفقت فبرونيكتين في جميع أنحاء الجزيرة. (2) والمصنفة خلايا هيلا في المناطق المحيطة بالجزيرة. (3) وبعد الوصول إلى نقطة التقاء خلايا هيلا وبيوفيلم المتعايشة قد وضعت ، هو عرض EHEC في الجزيرة. (4) رفع الجدار PDMSحتى كشف خلايا هيلا المحيطة بالجزيرة لEHEC. أقحم يوضح تفاصيل عملية صمام.
الشكل 2 : نموذج ميكروفلويديك للثقافة مشتركة من الخلايا الظهارية والبكتيريا. (A) ثلاثة الابعاد تسليم الجهاز المشترك الثقافة تبين هوائيا ، دفعتها إلى مناطق محاصرة لتشكيل الجزر البكتيرية بين الخلايا الظهارية. كل جزيرة الجرثومية (1200 و 1000 قطرها ميكرون وبصرف النظر ميكرومتر) يحتوي على مدخل ومخرج منفصل لتوفير وسائط النمو وإزالة المخلفات من الجزيرة. (ب) صورة مجهرية من الجهاز المشترك مع ثقافة الأصباغ الملونة التي تبين مناطق مختلفة (طلائي منطقة الخلية ، والجزر الجرثومي). (C) ويظهر الإخلاص للنظام هوائي محاصرة من خلال خفض الجدار PDMS (اللوحة اليسرى) باستخدام قناة تنشيط هوائيا (الأزرق) ، وإدخال الصباغ الأرجواني في الجزر جزيرة مغلقة ، وتتدفق الصبغة الصفراء حولها لمدة 48 ساعة. عندما يتم رفع الجدار PDMS (اللوحة اليمنى) ، يتعرض للمنطقة الجزيرة لصبغ أصفر المحيطة بها. شريط النطاق يمثل 500 ميكرون.
الشكل 3 : الرئيسان ثقافة خلايا هيلا والبكتيريا. (أ) صورة من الإسفار RFP - معربا عن EHEC وGFP - معربا عن E. القولونية BW25113 في الجزيرة. (ب) التي تنتقل من تراكب ، أخضر ، أحمر والصور مضان في الجهاز. شريط النطاق تمثل 200 ميكرون.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
المقايسات التقليدية للمرفق الممرض والاستعمار الاستفادة من أحادي الطبقة من الخلايا حقيقية النواة في لوحات زراعة الأنسجة التي تضاف إلى مسببات الأمراض. هذه النماذج ليست ذات صلة من الناحية الفسيولوجية لأنها لا تشتمل على البكتيريا المتعايشة بيوفيلم المتقدمة على خلايا حقيقية النواة. علاوة على ذلك بسيط للثقافة قبل نمت البكتيريا إلى خلايا حقيقية النواة من غير المرجح أن تؤدي إلى هذا التشكل كما هي درجة عالية من التنظيم الأغشية الحيوية الهياكل التي تتطور مع مرور الوقت ، وأنه من الصعب للغاية ، إن لم يكن مستحيلا ، لثقافة حقيقية النواة الخلايا في وجود البكتيريا لفترات طويلة من الزمن دون خسائر كبيرة في البقاء. منذ مسببات الأمراض لا تنقل من خلال بيوفيلم المتعايشة في هذه النماذج لإرفاق الخلايا الظهارية ، وهذه النماذج لا تحاكي بدقة وتنظيم الخلايا الظهارية والبكتيريا المتعايشة في الجهاز الهضمي. هنا ، ونحن الخطوط العريضة لتطوير جهاز ميكروفلويديك يستخدم هوائيا التي تسيطر عليها محاصرة للثقافة المشتركة للخلايا حقيقية النواة والبكتيريا. استخدام خلايا هيلا باعتبارها الخلية حقيقية النواة والنموذج خط EHEC مثل نموذج الممرض ، وتبين لنا أن الجهاز شارك في الثقافة يمكن أن تبقي على جزيرة معزولة المنطقة فضلا عن تقديم الدعم للزراعة وتنمية الخلايا المونولاير هيلا والمتعايشة E. بيوفيلم القولونية. وشارك في الثقافة ميكروفلويديك نموذج ليس فقط تمكن البكتيريا المتعايشة توطين والخلايا الظهارية ، ولكن أيضا قبل الكشف عن مسببات الأمراض إلى البكتيريا المتعايشة قبل مواجهة الخلايا الظهارية ، وبالتالي ، وتقديم بيئة أكثر من الناحية الفسيولوجية ذات الصلة خلال الاستعمار. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن للنموذج التعاون ثقافة أن تكون أداة مفيدة للدراسات الأساسية التي تركز على التحقيق في دور إشارات محددة بشأن العدوى EHEC فضلا عن تطبيقات مثل فحص سلالات بروبيوتيك المحتملة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل في جزء من مؤسسة العلوم الوطنية (CBET 0846453) ، والمعاهد الوطنية للصحة (1R01GM089999).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SU-8 2050 | MicroChem Corp. | ||
| high-resolution (16,256 dpi) photolithography mask | Fineline-Imaging Inc, CO | ||
| Trichloro(3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8-tridecafluorooctyl)silane | Sigma-Aldrich | 77279 | |
| PDMS | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH30002.02 | |
| Programmable spin coater | Laurell Tech Corp | WS0650S | |
| Mask aligner | Neurotronix | Q4000 | |
| Oxygen plasma etcher | March Plasma System, CA | CS-1701 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | ||
| Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit | Invitrogen | L-3224 |
References
- McDonald, J. C. Prototyping of microfluidic devices in poly(dimethylsiloxane) using solid-object printing. Anal Chem. 74, 1537-1545 (2002).
- Jeon, N. L. Design and fabrication of integrated passive valves and pumps for flexible polymer 3-dimensional microfluidic systems. Biomed Microdevices. 4, 117-121 (2002).
- Baek, J. Y., Park, J. Y., Ju, J. I., Lee, T. S., Lee, S. H. A pneumatically controllable flexible and polymeric microfluidic valve fabricated via in situ development. J Micromech Microeng. 15, 1015-1020 (2005).
- Grover, W. H., Ivester, R. H., Jensen, E. C., Mathies, R. A., A, R. Development and multiplexed control of latching pneumatic valves using microfluidic logical structures. Lab Chip. 6, 623-631 (2006).
- Lee, J., Jayaraman, A., Wood, T. K., K, T. Indole is an inter-species biofilm signal mediated by SdiA. BMC Microbiol. 7, 42-42 (2007).
- Hsu, C. H., Folch, A. Microfluidic devices with tunable topographies. Appl Phys Lett. 86, 023508-023508 (2005).
- Hui, E. E., Bhatia, S. N.
- Lee, J. Y. Integrating sensing hydrogel microstructures into micropatterned hepatocellular cocultures. Langmuir. 25, 3880-3886 (2009).
- Kim, J., Hegde, M., Jayaraman, A. Co-culture of epithelial cells and bacteria for investigating host-pathogen interactions. Lab-on-Chip. , (2009).
