घुलनशील सिग्नल की मध्यस्थता सहभागिता जांच के लिए उपकला कोशिकाओं और बैक्टीरिया के सह संस्कृति Microfluidic

Summary

इस प्रोटोकॉल उपकला कोशिकाओं और जीवाणुओं के साथ - साथ और स्थानीय संस्कृति के लिए एक microfluidic सह संस्कृति मॉडल का वर्णन करता है. इस मॉडल रोगजनन पर अलग घुलनशील आणविक संकेतों की भूमिका की जांच के रूप में के रूप में अच्छी तरह से स्क्रीन ख्यात प्रोबायोटिक जीवाणु उपभेदों के प्रभाव के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

Abstract

मानव जठरांत्र संबंधी मार्ग (GI) एक अद्वितीय वातावरण में जो आंतों उपकला कोशिकाओं और गैर रोगजनक बैक्टीरिया (खानेवाला) एक समय में होना है. यह प्रस्ताव किया गया है कि microenvironment कि रोगज़नक़ खानेवाला परत में मुठभेड़ों उपनिवेशन की हद तक निर्धारण में महत्वपूर्ण है. रोगज़नक़ उपनिवेशण की जांच करने के लिए वर्तमान संस्कृति तरीकों को अच्छी तरह से इस परिकल्पना की जांच के रूप में वे एक तरह से है कि GI पथ microenvironment mimics में बैक्टीरिया और उपकला कोशिकाओं के सह संस्कृति सक्षम नहीं करते हैं करने के लिए अनुकूल नहीं हैं. यहाँ हम एक microfluidic सह संस्कृति मॉडल का वर्णन है कि यूकेरियोटिक कोशिकाओं और जीवाणुओं की स्वतंत्र संस्कृति के लिए सक्षम बनाता है, और रोगज़नक़ उपनिवेशण पर खानेवाला microenvironment के प्रभाव का परीक्षण. सह संस्कृति मॉडल खानेवाला विकासशील द्वारा प्रदर्शन किया है

Protocol

1. सिलिकॉन मानक SU 8 ¹ photolithography (इस वीडियो में दिखाया गया है) का उपयोग कर स्वामी का निर्माण.

1. मानक SU 8 photolithography तरीकों का उपयोग SU 8 "स्वामी" (एसयू 8 +२०५०, MicroChem, न्यूटन, MA) एक cleanroom में विभिन्न घटकों (अलग मोटाई के PDMS झिल्ली, कक्ष सह - संस्कृति) fabricating के लिए. बनाने इस तरह के मास्टर molds किसी भी microfabrication सुविधा (, जैसे, स्टैनफोर्ड Microfluidics फाउंड्री में गढ़े जा सकता है http://thebigone.stanford.edu/foundry/ ).
2. PDMS प्रतिकृति से पहले, एक वैक्यूम स्रोत से जुड़ी मास्टर से PDMS की आसान रिहाई की सुविधा desiccator में fluorosilane वाष्प SU-8 स्वामी एक कागज तौलिया fluorosilane की एक बूंद जोड़ें और एक मिनट के लिए वैक्यूम लागू बेनकाब. . वैक्यूम निकालें और fluorosilane के बयान के लिए 30 मिनट की अनुमति है. SU-8 मास्टर को भविष्य में प्रयोग के लिए एक बंद कंटेनर में रखें.

2. PDMS की SU आठ मास्टर से ² प्रतिकृति ढलाई

1. fluidic परत और परत नियंत्रण SU-8 मास्टर से PDMS की प्रतिकृति मोल्डिंग द्वारा बनाई गई हैं.
2. एक 10:1 wt में पूर्व बहुलक PDMS और पार linker मिक्स. अनुपात और 1hour (या जब तक हवा बुलबुले PDMS मिश्रण से हटा रहे हैं) के लिए एक desiccator में Degas.
3. एक पेट्री डिश में SU 8-मुख्य प्लेस और ध्यान से SU-8 मास्टर के शीर्ष पर PDMS मिश्रण डालना. देगास फिर PDMS.
4. एक मिनट के लिए 1200 rpm पर मोल्ड स्पिन मोल्ड पर 100μm के आसपास के एक समान मोटाई PDMS.
5. एक घंटे के लिए PDMS और SU-8 में 80 मास्टर मोल्ड ° सी युक्त PDMS इलाज पेट्री डिश हीट.
6. निकालें ठीक PDMS कवर hotplate से SU-8 मास्टर.
7. SU-8 मास्टर से PDMS मोल्ड पील.
8. दो बैक्टीरिया inlets, एक दुकान और एक साँस का बंदरगाह के लिए एक 20 गेज सुई कुंद अंत का उपयोग PDMS मोल्ड में चार छेद ड्रिल.

3. यह डिवाइस बहुपरत PDMS उपकरणों के संबंध: तीन शीर्ष परत है जो मुख्य चैनल, एक मध्यम वायवीय परत, और एक नीचे बैक्टीरियल परत है जिसमें बैक्टीरिया के लिए चैनल शामिल एक परतों के साथ इकट्ठे है. तीन परतों के रूप में नीचे वर्णित इकट्ठा कर रहे हैं.

1. PDMS झिल्ली के साथ मेथनॉल गीले और ध्यान से उन्हें उनके SU-8 मास्टर एक साफ संदंश का उपयोग मोल्ड से छील. एक teflon शीट पर प्लेस झिल्ली.
2. वायवीय और एक ऑक्सीजन प्लाज्मा चैम्बर पर fluidic परत झिल्ली रखें. 40 सेकंड (ऑक्सीजन दबाव 10 SCCM, आरएफ शक्ति 100W) के लिए प्लाज्मा पर मुड़ें.
3. प्लाज्मा के लिए जोखिम के बाद, (10 मिनट के भीतर) नीचे PDMS चैनल पर झिल्ली संदंश का उपयोग संरेखित. झिल्ली और PDMS परतों पर मेथनॉल जोड़ना परतों की मुक्त आवाजाही में मदद करता है, और संरेखण आसान बनाता है. इस मामले में, डिवाइस धुंध के एक टुकड़े पर रखा गया है मेथनॉल वाष्पकणों से बचने के लिए अनुमति देते हैं.
4. 80 ° C पर एक hotplate पर 8 एच. के लिए गठबंधन किया PDMS परतों इलाज
5. बांड के लिए 3.4 इकट्ठे समग्र PDMS डिवाइस पर शीर्ष चैनल - नीचे की परत पर न्युमेटिक झिल्ली संबंध के बाद, 3.2 कदम दोहराने.

4. PDMS ^3,4 डिवाइस कोडांतरण

1. Inlet और आउटलेट यूकेरियोटिक कोशिकाओं और बैक्टीरिया के बोने के लिए इस्तेमाल किया बंदरगाहों में छेद ड्रिल.
2. बंदरगाहों के लिए Tygon टयूबिंग (0.01 इंच आयुध डिपो) कनेक्ट और एक 20ml सिरिंज के साथ खींच द्वारा हवाई परत संचालित.
3. PDMS मॉडल और एक पूर्व एक ऑक्सीजन प्लाज्मा चैम्बर में साफ गिलास स्लाइड प्लेस. के लिए प्लाज्मा पर मुड़ें निर्वात लागू किए बिना 20 सेकंड (ऑक्सीजन दबाव 20 SCCM, आरएफ शक्ति 300W).
4. क्रम में द्वीप दीवार (PDMS) गिलास स्लाइड के संबंध के बीच संपर्क को रोकने के लिए तुरंत डिवाइस के लिए एक सिरिंज कनेक्ट और सिरिंज खींच रहा है और यह जगह में पकड़े द्वारा वैक्यूम लागू.
5. धीरे कांच पर PDMS मॉडल (2 मिनट के भीतर) दबाएँ.
6. 80 पर PDMS डिवाइस चिकित्सा ° C 10 मिनट के लिए.

5. Fibronectin साथ कांच की सतह का इलाज

1. यूवी के तहत हर बंदरगाह Tygon टयूबिंग को जोड़ने के बाद 15 मिनट के लिए डिवाइस जीवाणुरहित.
2. भरें और निष्फल पीबीएस चैनल में प्रवाह करने के लिए चैनल में किसी भी मलबे को हटाने के. 10 मिनट के लिए प्रवाह लागू करने के लिए हवाई बुलबुले को दूर करने के लिए. हवाई बुलबुले को आसानी से PDMS अपने गैस पारगम्यता की वजह से बच सकते हैं.
3. वायवीय करने के लिए चैनल में हवा के बुलबुले के गठन को रोकने के चैनल में एक रंग डाई समाधान भरें.
4. कांच पर यूकेरियोटिक सेल बोने की सुविधा के लिए, डिवाइस में 1 fibronectin के समाधान μg एमएल / परिचय और 37 पर 40 मिनट के लिए सेते डिग्री सेल्सियस
5. वृद्धि मीडिया के 1 एमएल के साथ अतिरिक्त fibronectin धो लें.

6. और खानेवाला ई. का गठन माप कोलाई biofilm मेंद्वीपों

1. ₆₀₀ आयुध डिपो M9 न्यूनतम मीडिया में खानेवाला बैक्टीरिया (जैसे, ई. कोलाई BW25113/pCM18) पतला ~ बंद कक्षों / द्वीपों में एक खानेवाला biofilm गठन के लिए 1 .
2. सकारात्मक तरल दबाव लागू करने के द्वारा द्वीप दीवार को बंद करें. एक घर दबाव हवा के लिए तरल कनवर्टर चैनल में हवा बुलबुला गठन को रोकने के लिए प्रयोग किया जाता है.
3. खानेवाला ई. परिचय वाल्व के साथ द्वीपों में कोलाई बंद कर दिया है, और बैक्टीरिया के 1 घंटे के लिए 32 में संलग्न करने के लिए अनुमति देते हैं डिग्री सेल्सियस
4. स्वाधीन जीवाणुओं को धो और 0.25mL/hr पर 12 घंटे के लिए एक पतला जीवाणु निलंबन (आयुध _डिपो 600 ~ 0.05) perfuse .
5. ताजा DMEM विकास मीडिया के साथ biofilm कुल्ला शिथिल संलग्न बैक्टीरिया को दूर करने के लिए और यूकेरियोटिक सेल अनुलग्नक के लिए तैयार है.
6. छवि Leica टीसीएस SP5 Confocal लेज़र स्कैनिंग माइक्रोस्कोप (Bannockburn, आईएल), और कल्पना biofilm वास्तुकला IMARIS ⁵ सॉफ्टवेयर का उपयोग कर का उपयोग biofilm.

7. बैक्टीरियल ^6-8 द्वीपों के आसपास यूकेरियोटिक कोशिकाओं सीडिंग

1. 5 x 10 ⁵ कोशिकाओं / एमएल के एक बोने घनत्व के लिए टिशू कल्चर और DMEM मीडिया में फ्लास्क resuspend से HELA कोशिकाओं Trypsinize.
2. 2 एमएल / मिनट का उपयोग कर एक Picoplus सिरिंज पंप (हार्वर्ड Apparattus, एमए) की एक प्रवाह दर पर डिवाइस में HELA कोशिकाओं का परिचय. सुनिश्चित करें कि द्वीप दीवार उतारा है ताकि जीवाणु biofilm HeLa सेल क्षेत्र से अलग है. यह कदम एक रोशनी खुर्दबीन के मंच पर किया जाना चाहिए और इतना है कि बोने की एकरूपता निर्धारित किया जा सकता है.
3. सेल आउटलेट दबाना चैनल और 6 घंटे के लिए सेते 37 डिग्री सेल्सियस में एक 5% _सीओ 2 इनक्यूबेटर में सेल निलंबन के आंदोलन को कम करने के लिए.
4. मध्यम विकास के साथ 0.5 एमएल / घंटा डिवाइस स्वाधीन कोशिकाओं को हटाने Perfuse.
5. HeLa खानेवाला और ई. के लिए DMEM मीडिया ताज़ा कोलाई हर 6 घंटे.

8. रोगजनक बैक्टीरिया के द्वीप और यूकेरियोटिक कोशिकाओं को जोखिम में परिचय

1. ई. तैयार कोलाई O157: H7 (EHEC) 100:1 200:1 (HeLa सेल प्रति EHEC की संख्या) के संक्रमण के एक (moi) बहुलता HELA कोशिकाओं को संक्रमित करने के लिए.
2. कुल्ला और बाहर शिथिल संलग्न खानेवाला बैक्टीरिया धो.
3. द्वीपों में एक पतला EHEC निलंबन (आयुध डिपो ₆₀₀ ~ 0.1) का परिचय.
4. 37 पर डिवाइस सेते ° सी में एक 5% 6 घंटे के लिए प्रवाह के बिना सीओ ₂ इनक्यूबेटर खानेवाला biofilm में मौजूद संकेतों को उजागर किया EHEC अनुमति देने के लिए.
5. PDMS दीवार लिफ्ट खानेवाला द्वीपों में EHEC 6 घंटे के लिए HELA कोशिकाओं को बेनकाब.
6. पीबीएस के साथ चैनल कुल्ला और लाइव / मृत किट (L3224, Invitrogen, सीए) का उपयोग कर रहते हैं और मृत कोशिकाओं के लिए दाग.
7. छवि Zeiss Axiovert 200M प्रतिदीप्ति खुर्दबीन और कई स्थानों में रहते हैं और मृत कोशिकाओं की संख्या का अनुमान है.

9. प्रतिनिधि ⁹ परिणाम

सैनिक पथ के संक्रमण में घटनाओं के अनुक्रम HELA कोशिकाओं की एक monolayer और एक खानेवाला ई. के विकास के द्वारा मजाक उड़ाया गया था कोलाई biofilm और खानेवाला biofilm EHEC HELA कोशिकाओं के संक्रमण के लिए पहले उजागर . microfluidic सह संस्कृति मॉडल के निर्माण में शामिल कदम चित्र 1 में दिखाया जाता है चित्रा 2A सह संस्कृति डिवाइस के एक 3 - आयामी प्रतिपादन से पता चलता है. सह संस्कृति डिवाइस यूकेरियोटिक सेल संस्कृति कक्ष और बैक्टीरियल द्वीप में दो क्षेत्रों चित्रा 2B में अलग अलग रंग रंजक (यूकेरियोटिक और क्षेत्रों बैक्टीरियल द्वीप के लिए हरे रंग के लिए बैंगनी) के साथ दिखाए जाते हैं. आसपास के यूकेरियोटिक क्षेत्र से जीवाणु संस्कृति क्षेत्रों को अलग करने की व्यवहार्यता चित्रा 2C रंग रंगों का उपयोग में दिखाया गया है चित्रा 3. उपकला कोशिकाओं और बैक्टीरिया के सह संस्कृति से प्रतिनिधि परिणाम से पता चलता है है. चित्रा 3A खानेवाला (हरा) biofilm द्वारा द्वीप के उपनिवेशण से पता चलता है EHEC (लाल). चित्रा 3B उपकला कोशिकाओं और खानेवाला ई. का मुक़ाबला से पता चलता है EHEC साथ कोलाई जीवाणु द्वीप में. EHEC और GFP व्यक्त खानेवाला बैक्टीरिया व्यक्त आरएफपी द्वीप में स्थानीयकृत हैं जब PDMS दीवार उतारा है, उपकला कोशिकाओं से जीवाणु द्वीप अलग करने की व्यवहार्यता illustrating.

चित्रा 1: सेल सह संस्कृति मॉडल में बोने की योजना है . (1) PDMS दीवार के लिए एक द्वीप के रूप में उतारा है, खानेवाला बैक्टीरिया द्वीप में पेश कर रहे हैं, और fibronectin द्वीप के चारों ओर प्रवाहित होती गई है. (2) HELA कोशिकाओं द्वीप के आसपास के क्षेत्रों में वरीयता प्राप्त कर रहे हैं. (3) HELA कोशिकाओं के बाद संगम तक पहुँचने और खानेवाला biofilm विकसित की है, EHEC द्वीप में शुरू की है. (4) PDMS दीवार उठाया हैHeLa EHEC के लिए द्वीप के आसपास कोशिकाओं को बेनकाब करने के लिए. वाल्व आपरेशन के इनसेट विवरण से पता चलता है.

चित्रा 2: उपकला कोशिकाओं और बैक्टीरिया के सह संस्कृति के लिए Microfluidic मॉडल . (ए) सह संस्कृति उपकला कोशिकाओं के बीच बैक्टीरिया द्वीपों बनाने के लिए pneumatically actuated फँसाने क्षेत्रों दिखा डिवाइस के तीन आयामी गायन. प्रत्येक जीवाणु द्वीप (1200 सुक्ष्ममापी व्यास और 1000 सुक्ष्ममापी अलावा) एक अलग और विकास मीडिया को उपलब्ध कराने और द्वीप से अपशिष्ट हटाने के लिए इनलेट आउटलेट है. (बी) डिवाइस सह संस्कृति के रंग रंगों के साथ विभिन्न क्षेत्रों (उपकला कोशिका के क्षेत्र, बैक्टीरियल द्वीपों) दिखा सूक्ष्मग्राफ. (सी) वायवीय फँसाने प्रणाली के निष्ठा PDMS दीवार (बाएं पैनल) कम pneumatically सक्रिय चैनल (नीला) का उपयोग बंद द्वीप द्वीपों में बैंगनी डाई शुरू, और यह चारों ओर 48 एच. के लिए पीले रंग बह द्वारा दिखाया गया है जब PDMS दीवार (सही पैनल) उठाया है, द्वीप क्षेत्र में आसपास के पीले रंग के संपर्क में है. स्केल बार 500 सुक्ष्ममापी का प्रतिनिधित्व करता है.

चित्रा 3: HELA कोशिकाओं और बैक्टीरिया के सह - संस्कृति. (ए) आरएफपी व्यक्त EHEC और GFP-व्यक्त ई. के प्रतिदीप्ति छवि द्वीप में BW25113 कोलाई. प्रेषित ओवरले (बी), हरे, और डिवाइस में लाल प्रतिदीप्ति छवियों. स्केल बार 200 सुक्ष्ममापी का प्रतिनिधित्व करता है.

Discussion

रोगज़नक़ लगाव और उपनिवेशण के लिए परम्परागत assays टिशू कल्चर प्लेटों में यूकेरियोटिक कोशिकाओं में जो रोगज़नक़ों जोड़ रहे हैं की एक monolayer का उपयोग. इन मॉडलों physiologically प्रासंगिक नहीं है के रूप में वे एक खानेवाला बैक्टीरिया यूकेरियोटिक कोशिकाओं पर विकसित biofilm शामिल नहीं करते हैं. एक पूर्व विकसित जीवाणु संस्कृति का सरल यूकेरियोटिक कोशिकाओं के अलावा इस रचना के लिए नेतृत्व के रूप में biofilms अत्यधिक संरचनाओं का आयोजन कर रहे हैं कि समय के साथ विकसित की संभावना नहीं है, और यह बहुत मुश्किल है, अगर लगभग असंभव नहीं है, जीवाणुओं की उपस्थिति में संस्कृति यूकेरियोटिक कोशिकाओं के लिए व्यवहार्यता में महत्वपूर्ण हानि के बिना समय की विस्तारित अवधि के लिए. चूंकि रोगज़नक़ों इन मॉडलों में खानेवाला biofilm के माध्यम से नेविगेट करने के लिए नहीं उपकला कोशिकाओं को देते हैं, इन मॉडलों सही और GI पथ में उपकला कोशिकाओं खानेवाला बैक्टीरिया के संगठन नहीं नकल करते हैं. यहाँ, हम एक microfluidic युक्ति है कि यूकेरियोटिक कोशिकाओं और बैक्टीरिया के सह संस्कृति के लिए pneumatically नियंत्रित फँसाने का उपयोग करता है के विकास की रूपरेखा. मॉडल यूकेरियोटिक सेल लाइन और मॉडल रोगज़नक़ के रूप में EHEC के रूप में HELA कोशिकाओं का उपयोग, हम बताते हैं कि सह संस्कृति डिवाइस द्वीप क्षेत्र रखने के पृथक रूप में के रूप में अच्छी तरह से खेती और एक HeLa सेल monolayer के विकास और एक खानेवाला ई. का समर्थन कर सकते हैं कोलाई biofilm. microfluidic मॉडल सह संस्कृति न केवल खानेवाला बैक्टीरिया और उपकला कोशिकाओं के स्थानीयकरण के लिए सक्षम बनाता है, लेकिन यह भी खानेवाला बैक्टीरिया के लिए रोगज़नक़ों पूर्व उजागर उपकला कोशिकाओं का सामना करने से पहले, इस तरह, उपनिवेशण के दौरान एक और अधिक physiologically प्रासंगिक वातावरण पेश. इसके अलावा, सह संस्कृति मॉडल मौलिक EHEC संक्रामकता पर के रूप में के रूप में अच्छी तरह से संभावित प्रोबायोटिक उपभेदों स्क्रीनिंग जैसे अनुप्रयोगों के लिए विशिष्ट संकेतों की भूमिका की जांच पर ध्यान केंद्रित अध्ययन के लिए एक उपयोगी उपकरण किया जा सकता है.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
SU-8 2050	MicroChem Corp.
high-resolution (16,256 dpi) photolithography mask	Fineline-Imaging Inc, CO
Trichloro(3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8-tridecafluorooctyl)silane	Sigma-Aldrich	77279
PDMS	Dow Corning	184 SIL ELAST KIT 0.5KG
DMEM	Thermo Fisher Scientific, Inc.	SH30002.02
Programmable spin coater	Laurell Tech Corp	WS0650S
Mask aligner	Neurotronix	Q4000
Oxygen plasma etcher	March Plasma System, CA	CS-1701
Syringe pump	Harvard Apparatus
Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit	Invitrogen	L-3224