Identification of Growth Inhibition Phänotypen durch Expression von bakteriellen Typ III Effektoren in Hefe Induced

Zusammenfassung

In diesem Video, beschreiben wir ein Verfahren zur Expression von bakteriellen Typ III Effektoren in Hefe und die Identifizierung der Effektor-induzierte Wachstumshemmung Phänotypen. Solche Phänotypen können anschließend genutzt werden, um Effektor-Funktionen und Ziele zu erläutern.

Zusammenfassung

Viele Gram-negative pathogene Bakterien mit einem Typ III Sekretionssystem für eine Suite von Effektor-Proteine ​​in das Cytosol der Wirtszellen zu translozieren. Innerhalb der Zelle unterwandern Typ III Effektoren Host zelluläre Prozesse, Immunantworten zu unterdrücken und zu fördern Wachstum des Pathogens. Zahlreiche Typ III Effektoren der pflanzlichen und tierischen bakterielle Erreger wurden bisher identifiziert, doch nur wenige von ihnen sind gut charakterisiert. Das Verständnis der Funktion dieser Effektoren wurde durch eine Kombination von funktionellen Redundanz wurde in den Effektor Repertoire eines bestimmten Bakterienstamm untergraben, die subtilen Wirkungen, die sie ausüben, um Virulenz, Rollen, die möglicherweise spezifisch für bestimmte Infektionen Stufen sind, und Schwierigkeiten bei der genetisch erhöhen können Manipulation bestimmter Krankheitserreger. Expression von Typ III Effektoren in der Hefe

Protokoll

I. Entwurf eines Yeast Expression System für Typ III Effektoren

Kalibrieren eines Hefe-System geeignet für die Expression des Typ III Effektor (s) von Interesse ist eine wichtige Aufgabe und kann einige trial and error erfordern. Faktoren von großer Bedeutung, dass betrachtet und optimiert werden sollte bei der Gestaltung eines solchen Systems sind: 1) den Promotor die Expression des Effektors (s), 2) die Kopienzahl der Effektor-Gen, 3) die Epitop-Tag verwendet, um Protein-Expression zu überprüfen und 4) den Hefestamm.

1) Promoter

Da bakterielle Typ III Effektoren können giftig sein, um....

Diskussion

In diesem Vortrag dargestellt wir, wie die Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae als einem heterologen System für die Expression des Typ III bakteriellen Effektor-Proteine ​​und wie Effektor-induzierte Wachstumshemmung Phänotypen identifizieren können. Wichtig ist, dass diese Phänotypen in genetischen Screens genutzt werden, um Unterdrücker der negativen Auswirkungen von Effektoren auf das Wachstum der Hefe zu identifizieren. Suppressors darstellen können entweder direkte Ziele des Effektors studiert oder Protein.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Hefeextrakt	Difco Laboratories	212750
Pepton	Difco Laboratories	211677
D-Glukose	Sigma-Aldrich	G5767
Agar	Difco Laboratories	214010
Natriumhydroxid (NaOH)	Sigma-Aldrich	S8045
Hefestickstoffbase ohne Aminosäuren	Difco Laboratories	291940
Synthetisches Hefe-Depletion-Medium-Zusatz	Sigma-Aldrich	Y2001
D-Galactose	Sigma-Aldrich	G0750	>99 %; <0,1 % Glukose
D-Raffinose	Sigma-Aldrich	R0250	>98 %
L-Leucin	Sigma-Aldrich	L8000
Uracil	Sigma-Aldrich	U0750
L-Tryptophan	Sigma-Aldrich	T0254
L-Histidin	Sigma-Aldrich	H6034
DNA, einfachsträngig, aus Lachstestes	Sigma-Aldrich	D7656
Dimethylsulfoxid (DMSO)	Sigma-Aldrich	D5879	Trocken lagern
Salzsäure (HCl)	Sigma-Aldrich	H1758
Polyethylenglykol (PEG) 3350	Sigma-Aldrich	P4338
Lithiumacetat (LiAc)	Sigma-Aldrich	L4958
Tris (Base)	JT Baker	4109-02
Ethylenediamintetraessigsäure (EDTA)	Sigma-Aldrich	E5134
β-Mercapto–ethanol	Sigma-Aldrich	M6250
Glycerin	Sigma-Aldrich	G5516
Bromphenolblau	Sigma-Aldrich	B6131
Natrium-Dodecylsulfat (SDS)	Merck & Co., Inc.	8.22050.1000
Zentrifugenröhrchen (15 ml)	Corning	430052	Steril
Spektrophotometerküvette (10x4x45 mm)	Sarstedt Ltd	67.742
Inokulationshaken	Sigma-Aldrich	Z643009	Steril
Parafilm	Sigma-Aldrich	P7543
pH-Indikatorstreifen, pH 6,5–10,0	Merck & Co., Inc.	1.09543.0001