Herstellung von oligomeren β-Amyloid 1-42 Und Induktion der synaptischen Plastizität Impairment auf Schnitten des Hippocampus

Zusammenfassung

Ein Merkmal der Alzheimer-Krankheit ist die Erhöhung der Aß _1-42 Peptid. Hier bieten wir ein Protokoll zur Herstellung von synthetischen Aß _1-42 Oligomere, die Hippocampus Langzeit-Potenzierung beeinträchtigt, ein zelluläres Korrelat der Erinnerung. Dieses Verfahren ist nützlich für die Untersuchung von Mechanismen der Aß-induzierte Pathologie und Wirkstoff-Screening.

Zusammenfassung

Wertminderung von synaptischen Verbindungen geeignet ist, die subtilen amnesic Veränderungen in den frühen Stadien der Alzheimer-Krankheit (AD) zugrunde liegen. β-Amyloid (Aß), ein Peptid, in hohen Mengen in AD produziert, ist bekannt, dass Langzeit-Potenzierung (LTP), ein zelluläres Korrelat von Lernen und Gedächtnis zu reduzieren. In der Tat ist LTP Beeinträchtigung durch Aß verursacht eine nützliche experimentelle Paradigma zur Untersuchung synaptischer Funktionsstörungen in AD-Modellen und zum Screening von Drogen in der Lage zu mildern oder Zurücksetzen wie synaptic Beeinträchtigungen. Studien haben gezeigt, dass Aß die LTP Unterbrechung produziert bevorzugt über ihr oligomerer Form. Hier bieten wir Ihnen ein detailliertes Protokoll für beeinträchtigen LTP durch Perfusion von oligomerisierten synthetischen Aβ1-42-Peptid auf akuten Schnitten des Hippocampus. In diesem Video, skizzieren wir eine Schritt-für-Schritt-Verfahren zur Herstellung von oligomeren Aß

Protokoll

Resuspendieren β-Amyloid-Peptid

Bevor Sie beginnen müssen bereit:

• Aß _1-42 (gefriergetrocknetes Pulver)
• 1,1,1,3,3,3-Hexafluor-2-propanol (HFIP)
• Low-Bindung Polypropylen Mikrozentrifugenröhrchen (1,5 ml)
• Gasdichte Hamilton-Spritze mit Teflon stürzen zu stoppen (250 ul)
• Dimethylsulfoxid (DMSO)

1. Lassen lyophilisiert Aß _1-42 bei Raumtemperatur für 30 Minuten ins Gleichgewicht zu Kondensation beim Öffnen der Peptid-Fläschchen zu vermeiden.
2. Unter der Abzugshaube, resuspendieren Aß-Peptid _1-42 in eiskaltem HFIP zu einer 1 mM Lösung und ....

Diskussion

Wie oben beschrieben, können verschiedene Probleme in der Herstellung von oligomeren Aß in unbeeinträchtigt LTP führen. Eine Möglichkeit zu prüfen, ob Aß Abbau oder der Mangel an Aß Oligomerisierung stattgefunden haben könnte ist, die Aß Vorbereitung mit Tris-Tricin PAGE / Western Blot-Analyse und analytische Ultrazentrifugation (noch nicht in diesem Protokoll beschrieben) zu bewerten. Als Western Blot Proben unter non-denaturing/non-reducing Bedingungen vorbereitet sind, sollte eine erfolgreiche Vorbereitung erzeugen e.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Aβ 1-42 (lyophilisiert)	American Peptide	62-0-80
1,1,1,3,3,3-Hexafluor-2-Propanol (HFIP)	Fluka	52517
Dimethylsulfoxid (DMSO)	Biotium, Inc.	90082
50-mL-Polypropylen-Zentrifugenröhrchen	Corning	05-538-67
1,5-ml-MaxyClear-Mikroröhrchen mit maximaler Rückgewinnung	Axygen Scientific	MCT-150-L-C
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung, pH 7,4	Invitrogen	10010-023
GASTIGHT-Spritzen 250 μL	Hamilton Co	1725
Ultraschallbad	Branson	3510
Savant SpeedVac-Konzentratoren-System	Verschiedene	SC 110A