Montage von adulten Drosophila-Gehirnen: Eine Methode zur Vorbereitung von Objektträgern für die konfokale Bildgebung

Dieses Protokoll ist ein Auszug aus Kelly et al., Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains, J. Vis. Exp. (2017).

1. Montage von adulten D. melanogaster-Gehirnen auf Objektträger und Bildgebung

1. Baue eine "Brücken"-Rutsche. Positionieren Sie zwei "Basis"-Deckgläser im Abstand von ca. 1 cm auf einem positiv geladenen Objektträger. Stellen Sie sicher, dass die positiv geladene Seite des Objektträgers nach oben zeigt. Kleben Sie die Deckgläser mit Fingernagellack auf die Folie, wie in Abbildung 1A gezeigt. In der Regel ist es hilfreich, die drei Außenkanten jedes Unterlagenabdeckschlaufens mit Fingernagellack zu versiegeln, um sicherzustellen, dass Einbettmedien nicht unter diesen Unterlagenschiebern ableiten. Lassen Sie den Fingernagellack vollständig trocknen (10 - 15 min), bevor Sie fortfahren.
2. Legen Sie den Objektträger unter das Stereomikroskop und pipettieren Sie die Eindeckmedienlösung mit den präparierten Gehirnen in den Raum zwischen den beiden Deckgläsern. Um mehr Kontrast zu erzielen, ist es sinnvoll, die Schwanenhalsleuchten so zu manövrieren, dass sie parallel zur Tischplatte stehen.
3. Entfernen Sie überschüssiges Eindeckmedium mit einer Pipette vom Objektträger und achten Sie darauf, das Gehirn nicht vom Objektträger zu pipettieren.
4. Leiten Sie überschüssige Eindeckmedien ab. So können die Gehirne im nächsten Schritt genauer positioniert werden.
5. Positionieren Sie das Gehirn mit einer Pinzette und dem Stereomikroskop in einem Gittermuster auf dem Objektträger, wobei die Antennenlappen nach oben zeigen.
6. Legen Sie ein Deckglas (die "Brücke") über das Gehirn (Abbildung 1A). Verwenden Sie Fingernagellack, um die Seiten des Brückenabdeckschlaufens an der Stelle zu versiegeln, an der sie mit den "Basis"-Abdeckschiebern in Kontakt kommen.
7. Füllen Sie mit einer p200-Pipette den mittleren Hohlraum unter der Brücke langsam mit frischem Einbettmedium (Abbildung 1B). Legen Sie einen Tropfen nach dem anderen auf die offene Kante des mittleren Deckglases und lassen Sie das Montagemedium unter dem mittleren Deckglas des Stegs hindurchgleiten. Fahren Sie fort, bis der gesamte Hohlraum mit Eindeckmedien gefüllt ist, und versiegeln Sie dann die Ober- und Unterseite mit klarem Fingernagellack.
8. Sobald der Fingernagellack getrocknet ist, belichten Sie die Dias sofort oder lagern Sie sie in einer lichtdichten, dichten Diabox bei -20 °C.
9. Innerhalb einer Woche werden Gehirne mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop mit Anregungslasern und Filterwürfeln abgebildet, die für die ausgewählten fluoreszierenden Sekundärantikörper geeignet sind. Z-Stapel-Bilder von Pilzkörperneuronen werden typischerweise mit 20X- oder 40X-Objektiven aufgenommen. Die Bildgebung von retinalen Photorezeptorneuronen kann eine höhere Vergrößerung erfordern.

Abbildung 1: Montage von Gehirnen zur Vorbereitung der Immunfluoreszenzbildgebung. (A) Die Gehirne sind auf SuperFrost Plus-Schienen mit einer Brückenabdeckung montiert, um eine Abflachung des Gehirns zu verhindern. Zwei "Basis"-Deckgläser werden mit klarem Fingernagellack auf einen positiv geladenen Superfrost Plus-Objektträger geklebt und dann sezierte Gehirne auf den Objektträger dazwischen gelegt. Ein durchsichtiger "Brücken"-Deckslip wird über das Gehirn gelegt und auf die Basis-Deckgläser geklebt. (B) Nach dem Trocknen des Fingernagellacks wird Vectashield langsam unter die Brücke pipettiert, um die Fluoreszenz des Sekundärantikörpers zu erhalten. Klarer Fingernagellack wird dann verwendet, um die Ober- und Unterseite des Deckglases "Brücke" abzudichten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.