$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Dieses Protokoll ist ein Auszug aus Zhang et al., The C. elegans Intestinal As a Model for Intercellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis at the Single-cell level: Labeling by antibody staining, RNAi Loss-of-function Analysis and Imaging, J. Vis. Exp. (2017).
Antikörperfärbung des C. elegans-Darms
- Fixierung
- Nehmen Sie einen sauberen Objektträger und verwenden Sie Poly-L-Lysin, um einen dünnen Film zu erzeugen, an dem die Würmer haften können. Geben Sie 30 μl 0,1-0,2 % Poly-L-Lysin auf den Objektträger und legen Sie einen zweiten Objektträger auf den Poly-L-Lysin-Tropfen, um ein "Sandwich" zu bilden. Reiben Sie dann die Objektträger ein paar Mal vorsichtig, um die gesamten Oberflächen beider zu befeuchten, und lassen Sie sie 30 Minuten lang an der Luft trocknen. Beschriften Sie die mattierte Seite der Folien mit Bleistift.
HINWEIS: 0,2% Poly-L-Lysin-Aliquots von 200 μL wurden durch Auflösen des Pulvers in dH2O hergestellt; Dieses kann bei -20 °C gelagert werden. Verwenden Sie hochmolekulares Poly-L-Lysin für ein verbessertes Anhaften der Würmer. Entscheidend ist auch die Konzentration von Poly-L-Lysin. Zu niedrige Konzentrationen lassen die Würmer nicht haften, aber zu hohe Konzentrationen können ein Fluoreszenz-Hintergrundsignal erzeugen. Ein zu dicker Film kann sich in seiner Gesamtheit auflockern.
- Legen Sie einen flachen Metallblock fest auf den Boden eines mit flüssigem Stickstoff gefüllten Behälters (z. B. eines Styroporbehälters.
HINWEIS: Man kann stattdessen Trockeneis verwenden, aber flüssiger Stickstoff hält einen Metallblock stabiler auf dem Behälterboden und kühlt gut.
- Sammle Würmer, indem du sie entweder mit M9 von ihren Tellern wäschst, oder wähle verschiedene Würmer (entweder Eier, L1-, L2-, L3- oder L4-Larvenwürmer) auf jeden Objektträger. In der Regel wählen Sie ~100 Larven und Embryonen oder ~20 erwachsene Tiere für jeden Objektträger aus. Geben Sie 10 μL abgewaschene Würmer auf die Mitte des Objektträgers oder pflücken Sie Eier/Würmer in 10 μL M9 oder 10 μL 1x PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung).
- Verwenden Sie eine Pipette, um eine große Anzahl von Würmern zu verteilen, um ein Verklumpen zu vermeiden.
Hinweis: Gemischte Populationen von abgewaschenen Würmern haften aufgrund der Überfüllung und der unterschiedlichen Dicke der Stadien nicht gut und sind weniger effektiv gefriergecrackt (siehe unten), daher führt die Auswahl von stadienspezifischen Würmern (oder synchronisierten Populationen) zu besseren Ergebnissen. Larven stechen besser als erwachsene Tiere und es können mehr Tiere pro Objektträger platziert werden.
- Bevor Sie Würmer auf Objektträger pflücken, übertragen Sie sie auf eine Nematoden-Wachstumsmedium (NGM)-Platte ohne OP50-Bakterien. Überschüssige Bakterien, die an den Würmern haften, können das Anhaften ebenfalls beeinträchtigen. Achten Sie darauf, dass die Würmer nicht austrocknen.
- Legen Sie ein 22 mm × 22 mm langes Deckglas vorsichtig quer über die gesammelten Würmer auf die gesammelten Würmer, so dass seine Ränder auf mindestens einer Seite des Objektträgers überhängen. Drücken Sie mit einem oder zwei Fingern sanft, aber fest gerade nach unten. Vermeiden Sie Scherungen, die die Integrität des Gewebes beeinträchtigen.
- Übertragen Sie den Objektträger sofort und vorsichtig in flüssigem Stickstoff auf den Metallblock und lassen Sie ihn etwa 5 Minuten lang einfrieren. Dann "schnippen" Sie das Deckglas mit einer schnellen Bewegung ab, indem Sie die überhängende Kante verwenden.
HINWEIS: Dieser Schritt muss entschlossen und während der Objektträger eingefroren durchgeführt werden, um ein "Knacken" der Nagelhaut zu erreichen. Achtung: Bitte beachten Sie die PSA-Richtlinien (Persönliche Schutzausrüstung), wenn Sie mit flüssigem Stickstoff arbeiten.
- Tauchen Sie die gefriergerissenen Objektträger für 5 Minuten bei -20 °C in ein mit Methanol gefülltes Coplin-Glas. Dann für weitere 5 min bei -20 °C in ein mit Aceton gefülltes Coplin-Glas umfüllen.
HINWEIS: Methanol und Aceton sollten vor der Verwendung mindestens 30 Minuten bei -20 °C gelagert werden. Nach der Fixierung können die Objektträger bei -20 °C gelagert werden.
ACHTUNG: Methanol und Aceton sind giftig.
- Nehmen Sie die Objektträger aus dem Glas und lassen Sie sie vor Gebrauch bei Raumtemperatur (RT) an der Luft trocknen.