Dieses Protokoll ist ein Auszug aus Teoh et al., Quantitative Approaches for Studying Cellular Structures and Organelle Morphology in Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2019).
Vorbereitung von Objektträgern für die Bildgebung
- Bereiten Sie 3-4 % w/v Agarosebrühe in einer mikrowellengeeigneten Flasche zu (3-4 g in 100 mL Reinstwasser).
HINWEIS: Agar kann anstelle von Agarose in der gleichen Konzentration verwendet werden.
- Die Agarose vorsichtig in der Mikrowelle schmelzen und dabei darauf achten, dass sie nicht überkocht, bis sich die gesamte Agarose aufgelöst hat (klare Lösung). Halten Sie die Lösung bei 70 °C, um eine Verfestigung zu vermeiden.
HINWEIS: Agarose-Brühe kann mehrmals verwendet werden. Vor Gebrauch erneut erhitzen, wenn sich die Agarose verfestigt hat.
- Geben Sie mit einer Pasteur-Pipette einen Tropfen geschmolzene Agarose auf einen Objektträger.
HINWEIS: Vermeiden Sie Luftblasen im Agartropfen, da diese die Integrität des Pads stören.
- Drücken Sie das Agarose-Tröpfchen sofort mit einem weiteren Objektträger nach unten und drücken Sie die Agarose vorsichtig zu einem Pad zwischen den beiden Objektträgern ab.
HINWEIS: Zu diesem Zeitpunkt sollten alle übrig gebliebenen Blasen entfernt werden. Wenn nicht, sollten neue Rutschen gemacht werden, da Tiere leicht in den Blasen stecken bleiben können. Vermeiden Sie ein Überlaufen des Agars zur Seite, wenn Sie auf den Objektträger drücken.
- Lassen Sie die Agarose 1 Min. trocknen.
- Trennen Sie die beiden Gleiter vorsichtig, um eine Beschädigung der Agarose zu vermeiden, und lassen Sie das erstarrte Pad auf einem der Objektträger.
HINWEIS: Objektträger mit Agarose-Pads sollten immer kurz vor dem Versuch frisch zubereitet werden, da sie austrocknen können. Stellen Sie sicher, dass das Agarose-Pad eine gleichmäßige Dicke hat. Es sollten keine Luftblasen oder Risse im Pad vorhanden sein, da dies die Bildgebung beeinträchtigen kann.
- Geben Sie einen kleinen Tropfen (5-10 μl) 0,05 % Tetramisolhydrochlorid (Anästhetikum) in die Mitte des Agarose-Pads.
- Übertragen Sie mit einem hitzesterilisierten Pickel schnell etwa 10 – 15 Tiere von der Lagerplatte in das Narkosetröpfchen, bevor die Lösung austrocknet. Vermeiden Sie die Übertragung von zu vielen OP50-Bakterien, da dies die Lösung trüb macht, was die Bildgebung beeinträchtigen kann.
HINWEIS: Trocknet die Narkoselösung beim Pflücken aus, pipettieren Sie einfach einen zweiten Tropfen 0,05% Tetramisolhydrochlorid auf die Tiere. Die Tiere neigen dazu, in der Narkoselösung auf der Seitenseite zu liegen.
- Bringen Sie ein Deckglas an, indem Sie es direkt über dem Agarose-Pad positionieren und vorsichtig nach unten fallen lassen. Dadurch wird die Bildung von Blasen verhindert. Üben Sie keinen Druck auf das Deckglas aus, da dies die Tiere zerquetschen kann.
- Beschriften Sie die Folien mit dem Namen des Stammes.