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Dieses Protokoll ist ein Auszug aus Tauc et al., Isolating Intestinal Stem Cells from Adult Drosophila Midguts by FACS to Study Stem Cell Behavior During Aging, J. Vis. Exp. (2014).
HINWEIS: Wenn dieses Protokoll zum ersten Mal verwendet wird, um ISCs durch FAC-Sortierung zu isolieren, sind die folgenden Kontrollen zwingend erforderlich, um die FACS-Parameter zunächst richtig einzustellen: Dissoziierte Zellen aus Wildtyp-(z.B. w1118) Drosophila-Mitteldärmen ohne Sytox. Dissoziierte Zellen aus dem Wildtyp-Mitteldarm (z.B. w1118) Drosophila mit Sytox (siehe Schritt 3.6). Dissoziierte Zellen aus dem Mitteldarm der esg-Gal4, UAS-GFP-Fliegenlinie ohne Sytox.
1. Zubereitung von Lösungen und Gerichten für die Darmdissektion
- Bereiten Sie 4-6 Fläschchen mit je 40 weiblichen Fliegen aus der esg-Gal4, UAS-GFP Fliegenschnur vor.
- Aus einer 10x PBS-Stammlösung 500 ml 1x PBS (1,8 mM NaH2PO4·H2O, 8,4 mM Na2HPO4,2H 2O, 175 mM NaCl, pH-Wert auf 7,4 einstellen).
- Bereiten Sie eine 3,5%ige Agaroselösung in 1x PBS (3,5 g Agarose in Elektrophoresequalität in 100 ml 1x PBS) vor. Bereiten Sie Präparierplatten vor, indem Sie diese Lösung in Petrischalen (Durchmesser 8,5 cm) gießen, um den Boden zu bedecken. Die Agaroseschicht verhindert eine Beschädigung der Pinzettenspitzen während des Präpariervorgangs. Nachdem das Gel fest geworden ist, lagern Sie die Präparierplatten bei 4 °C.
- Vor dem Präparieren 300 ml 1x PBS + 1% BSA frisch zubereiten und die Flasche auf Eis oder bei 4 °C stellen.
- Schalten Sie die Zentrifuge ein und lassen Sie sie auf 4 °C abkühlen.
- Die Spitzen von 2 Pasteur-Pipetten aus Glas flammen, um die Ränder zu glätten.
- Reinigen Sie zwei Paar Pinzetten und eine Rasierklinge mit 70% Ethanol.
- Legen Sie vier bis sechs 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen zum Sammeln von präparierten Mitteldärmen auf Eis.
2. Vorbereitung des Magen-Darm-Traktes und Dissektion des Mitteldarms
- Betäuben Sie Fliegen aus einem Fläschchen (40 Fliegen) mit CO2 auf einer handelsüblichen Fliegenliege, enthaupten Sie alle Fliegen mit einer Rasierklinge und geben Sie sie in die Sezierschale. Gießen Sie kalte 1x PBS/1% BSA-Lösung in die Sezierschale, um das Agarosegel zu bedecken. Die Fliegen werden schwimmen.
- Fassen Sie den Fliegenbauch mit einer Pinzette, während Sie den Brustkorb mit der anderen Pinzette halten. Trenne den Thorax vom Bauch. Der Darm wird sichtbar sein und der Vorderdarm/Kropf wird höchstwahrscheinlich noch mit dem Thorax verbunden sein.
- Greifen Sie nach dem Darm und ziehen Sie ihn aus dem Brustkorb. Um den Darm zu entfalten, greifst du nach der Gerte und ziehst den Darm leicht nach vorne vom Bauch weg.
- Fassen Sie mit einer Pinzette das hintere Ende des Bauches und mit der anderen Pinzette den Rand der vorderen offenen Nagelhaut. Achten Sie darauf, das herstehende Darmgewebe nicht zu zerstören. Ziehen Sie das hintere Ende weg, um die Nagelhaut zu brechen, und ziehen Sie ganz vorsichtig weiter nach hinten, bis der gesamte Darm aus der Bauchhöhle gezogen wurde. Möglicherweise muss der Kropf vorher entfernt werden, wenn er zu groß ist, um durch die Körperhöhle zu passen.
- Entfernen Sie den Vorderdarm, die Malpighschen Tubuli, den Hinterdarm und die Eierstöcke, wobei der nackte Mitteldarm übrig bleibt.
- Übertragen Sie die Charge der präparierten Mitteldärme mit einer Pasteur-Glaspipette in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit kalter 1x PBS/1%iger BSA-Lösung und halten Sie das Röhrchen auf Eis. Die Proben müssen innerhalb von 2 Stunden verarbeitet werden.
- Nachdem das Sezieren einer gesamten Charge abgeschlossen ist, spülen Sie die Sezierschale mit doppelt destilliertem Wasser aus, um Reste abzuwaschen. Beginnen Sie mit dem Sezieren der nächsten Charge von Mitteldärmen (wiederholen Sie die Schritte 2.1–2.7). Zerlegen Sie innerhalb von 2 Stunden so viele Chargen wie möglich und fahren Sie dann mit Schritt 3.1 fort.
3. Verdauung des Darmgewebes zur Gewinnung von Zellen für die FAC-Sortierung
- Entfernen Sie die 1x PBS/1%ige BSA-Lösung aus dem Mitteldarm und fügen Sie jeder Probe 500 μl 0,5%ige Trypsin-EDTA-Lösung hinzu.
- 20 Sekunden lang gut durchziehen und die Proben durch leichtes Schaukeln/Drehen bei 20 U/min bei Raumtemperatur für 25-30 min inkubieren.
- Nach ca. 30 min erneut vortexen und das intakte Mitteldarmgewebe auf den Boden der Röhre sinken lassen. Entfernen Sie vorsichtig die Zellen, die sich in Suspension befinden, mit einer Pasteurpipette aus geflammtem Glas und filtrieren Sie sie durch ein 35 μm Nylonnetz in ein frisches 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen.
- Schleudern Sie die Zellen bei 100 x g für 5 min bei 4 °C herunter. Zu beachten ist, dass beim Starten des Verdaus ein Zellpellet zunächst nicht sichtbar sein kann, aber im Laufe des Gewebeverdaus sichtbar wird.
- Übertragen Sie die Trypsin-Lösung vorsichtig zurück in das ursprüngliche Probenröhrchen, das das verbleibende intakte Mitteldarmgewebe enthält. Vermeiden Sie es, zu viele Zellen aus dem Pellet zu übertragen.
- Suspendieren Sie das Zellpellet vorsichtig wieder in 400 μl kaltem 1x PBS/1% BSA. Bewahren Sie die Mikrozentrifugenröhrchen mit den dissoziierten Zellen auf Eis auf und decken Sie die Röhrchen mit Aluminiumfolie ab, um die Zellen vor Licht zu schützen.
- Die Trypsin-Lösung, die das verbleibende intakte Mitteldarmgewebe enthält, erneut vortexen und die Proben für weitere 30 min bei Raumtemperatur auf die Wippe legen.
- Wiederholen Sie die Schritte 3.3 bis 3.4.3, bis das gesamte Mitteldarmgewebe verdaut ist. Kombinieren Sie die dissoziierten Zellen aus allen Mikrozentrifugenröhrchen in einem Mikrozentrifugenröhrchen. Dies kann einen Zentrifugationsschritt wie in Nummer 3.4 erfordern, da das Volumen aller Zellsuspensionen zusammen 1,5 ml überschreiten kann. Halten Sie die Zellsuspension auf Eis und schützen Sie die Zellen vor Licht.
- Schleudern Sie die dissoziierten Zellen bei 100 x g für 5 min bei 4 °C herunter. Entfernen Sie vorsichtig so viel Überstand wie möglich, wobei ca. 50-100 μl der 1x PBS/1%igen BSA-Lösung im Mikrozentrifugenröhrchen verbleiben. Resuspendieren Sie die dissoziierten Zellen vorsichtig in 800 μl 1x PBS/1% BSA, das Sytox (1:20.000) enthält.
- Übertragen Sie die Zellsuspension in ein 5-ml-Falcon-Röhrchen mit rundem Boden, indem Sie die Zellen durch eine Schnappkappe des Zellsiebs (35 μm Nylonnetz) filtrieren. Bewahren Sie Zellproben immer auf Eis und lichtgeschützt auf. Die Zellen können nun sortiert werden.
- Pipettieren Sie 600 μl RNAlater-Lösung in jedes Mikrozentrifugenröhrchen, in das die Zellen für die anschließende RNA-Isolierung einsortiert werden. Für andere Downstream-Anwendungen können die Zellen in einer anderen Lösung, z.B. in sterilem PBS, gesammelt werden.