$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Das folgende Protokoll ist ein Auszug aus Cornwell et al., The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitative Measure Caenorhabditis elegans Lifespan, J. Vis. Exp. (2018).
>1. Verhinderung der Nachkommenproduktion durch Zugabe von 5-Fluor-2'-Desoxyuridin (FUdR)
- Die Tiere werden bis zum Stadium L4 bei 20 °C gezüchtet. Etwa 40 h nach der Aussaat (Schritt 2.1.7) ist zu prüfen, ob sich die synchronisierten Tiere zu L4 entwickelt haben.
HINWEIS: Die Entwicklungszeit von C. elegans variiert bei unterschiedlichen Temperaturen und die Wachstumsraten von mutierten Tieren, für die keine Raten charakterisiert wurden, müssen empirisch getestet werden.
- 160 μL 50x FUdR auf jede 6 cm Platte mit L4-Tieren geben.
HINWEIS: Es ist wichtig, FUdR in der L4-Phase hinzuzufügen. Der Einfachheit halber können Sie 1.000x FUdR-Brühen herstellen, indem Sie 1 g FUdR in 10 mL ultrareines H2O auflösen. Sterilisieren Sie den FUdR-Schaft mit einem 0,2-μm-Filter und einer 10-cm³-Spritze. Aliquotieren Sie ~1 mL Stamm in sterile 1,5 mL Röhrchen. Einfrieren und bei -20 °C lagern.
- Die Platten auf das Vorhandensein von männlichen C. elegans untersuchen. Alle Männchen entfernen.
HINWEIS: Die Lebenserwartung wird in der Regel für Hermaphroditen und nicht für Männchen gemessen. Hermaphroditen, die sich paaren, leben kürzer als unverpaarte Tiere, selbst in Gegenwart von FUdR. Die Männchen sind kleiner und dünner als Hermaphroditen und sind leicht an einem markanten Hakenschwanz zu erkennen.
- Legen Sie die Schachtel wieder in den Zip-Lock-Beutel. Zurück zum 20 °C Inkubator.
>2. Rentabilität der Bewertung
- Erzielen Sie täglich die Lebensfähigkeit, indem Sie das Tier sanft mit einem Platindraht oder einer Wimper am Kopf berühren. Bewerten Sie Tiere, die sich nicht bewegen, als tot und entfernen Sie sie von der Platte (Abbildung 1A). Notieren Sie die Anzahl der beobachteten Toten für jeden Zustand für jeden Beobachtungszeitpunkt.
HINWEIS: Um das Risiko einer Scoring-Verzerrung zu verringern, muss der Experimentator für die experimentellen Bedingungen blind bleiben und darf sich bei der Bewertung ebenfalls nicht auf die Ergebnisse früherer Zeitpunkte beziehen.
- Zensieren Sie Tiere, die platzen, an anderen offensichtlichen Entwicklungsfehlern sterben oder an der Seite der Schale hochkriechen: Entfernen Sie diese Tiere und notieren Sie die Anzahl zu jedem beobachteten Zeitpunkt, um sie in der statistischen Analyse zu berücksichtigen. Wenn Männchen gefunden werden, entfernen Sie sie und notieren Sie die beobachtete Anzahl.
- Wiederholen Sie den Vorgang ab Schritt 2.1 täglich, bis keine Tiere mehr am Leben sind.
HINWEIS: Sollte der Rasen von E. coli stark schrumpfen oder Pilze auf der Platte zu wachsen beginnen, werden alle verbleibenden Tiere auf eine frische Platte mit der entsprechenden RNAi und FUdR umgelegt.
