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Dieses Protokoll ist ein Auszug aus Possik and Pause, Messung der oxidativen Stressresistenz von Caenorhabditis elegans in 96-Well-Mikrotiterplatten, J. Vis.(2015).
1. Durchführung des Oxidativen Stressresistenz-Assays
- Pipettieren Sie 40 μl der 100 mM PQ-Lösung (frisch zubereitet) in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte. Verwenden Sie mindestens 12 Wells als Replikate jeder Erkrankung (Behandlung, Mutante usw.). Setzen Sie mit einem Platindrahtwurmpickel 5-8 L4-Larven in jede Vertiefung um und geben Sie die Start- und Endzeit an.
- Wenn Sie eine andere Bedingung starten, notieren Sie sich die Startzeit und die Endzeit. Stellen Sie die Platte bei 20 °C in die Inkubationszeit zwischen dem Transfer der Würmer und dem Auswerten toter Tiere eine Stunde später als die Startzeit.
- Zählen Sie mit dem Präpariermikroskop alle Stunden das Überleben. Schütteln Sie die Platte vorsichtig, bevor Sie mit dem Zählen beginnen. Kennzeichnen Sie Würmer, die sich auch nach dem Erkennen eines hochintensiven Lichts nicht bewegen, als tote Tiere. Geben Sie auch die Anzahl der lebenden Tiere an.
HINWEIS: Die Betrachtung der Wurmform, des Schwanzes und der Kopfbewegung bei hoher Vergrößerung hilft dabei, tote Würmer von lebenden Würmern zu unterscheiden.
- Wiederhole diesen Schritt stündlich, bis die meisten Würmer tot sind.
2. Bestimmung des Überlebensprozentsatzes zu jedem Zeitpunkt
- Berechnen Sie die Gesamtzahl der Tiere pro Zustand, indem Sie die Gesamtzahl der Tiere addieren, die in jede Vertiefung übertragen wurden. Ignorieren Sie die Tiere, die beim Transfer beschädigt oder getötet werden.
- Berechnen Sie für jeden Zeitpunkt die Gesamtzahl der toten Tiere pro Zustand (Summe der toten Tiere in den 12 Vertiefungen). Berechnen Sie für jeden Zeitpunkt den Prozentsatz des Todes (Anzahl der toten Tiere dividiert durch die Gesamtzahl der Tiere und multipliziert mit 100) und den Prozentsatz des Überlebens (100 minus Prozentsatz des Todes).
- Wiederholen Sie diesen Assay mindestens 3 unabhängige Male.