Enzymatischer Verdau und manuelle Dissoziation: Eine Methode zur Vorbereitung von C. elegans-Embryonen für die Zellkultur

Zusammenfassung

Quelle: Sangaletti, R. und Bianchi, L. Eine Methode zur Kultivierung embryonaler C. elegans-Zellen.J. Vis. Exp.(2013).

Dieses Video stellt eine Methode zur Isolierung und sterilen Kultivierung embryonaler C. elegans-Zellen in vitro vor.

Protokoll

>1. Dissoziation embryonaler Zellen

1. Führen Sie die nächsten Schritte des Eingriffs unter sterilen Bedingungen mit einer Laminar-Flow-Haube durch. Während die Tiere auf Bakterienplatten gekleidet werden, sollten die Waschungen und die Behandlung mit der bleichmittelhaltigen Lyselösung die meisten, wenn nicht sogar alle Bakterien beseitigen. Die Verwendung einer laminaren Haube an dieser Stelle des Verfahrens verhindert somit eine erneute Kontamination der Eisuspension.
2. Resuspendieren Sie pelletierte Eier in 1 ml 2 mg/ml Chitinase (Stamm in Eipuffer pH 6,5) und geben Sie sie in ein neues steriles konisches 15-ml-Röhrchen. Schütteln Sie die Röhre für 10-30 Minuten bei Raumtemperatur. Die genaue Inkubationszeit variiert je nach Frische des Enzyms und der Raumtemperatur und sollte daher bei jedem Präparat bestimmt werden. Es wird empfohlen, die Eizellen nach 10 Minuten Inkubation unter einem inversen Zellkulturmikroskop zu überwachen. Hinweis: Unserer Erfahrung nach erhöht ein niedriger pH-Wert die enzymatische Aktivität der Chitinase. Aus diesem Grund verwenden wir Eipuffer mit einem pH-Wert von 6,5, um Chitinase aufzulösen (oben beschriebenes Rezept, bei dem der pH-Wert mit NaOH auf 6,5 eingestellt wird).
3. Wenn ~ 80 % der Eierschalen durch die Chitinase-Behandlung verdaut sind (Abbildungen 1 A-B), pelletieren Sie die Eier durch Zentrifugation bei 900 x g (~2.500 U/min) für 3 Minuten. Entfernen Sie mit einer P1000-Pipettierer und sterilen Spitzen vorsichtig den Überstand und fügen Sie 3 ml L-15-Medium hinzu.
4. Übertragen Sie die Eizellen in eine Platte mit einem Durchmesser von 6 cm und dissoziieren Sie die Zellen vorsichtig mit einer sterilen 10-ml-Spritze, die mit einer 18-G-Nadel ausgestattet ist. Überwachen Sie den Grad der Dissoziation, indem Sie einen Tropfen Suspension in eine frische Petrischale aus Kunststoff geben und unter dem Mikroskop betrachten. Saugen Sie während dieses Vorgangs keine Luft in die Spritze an, um eine Schädigung der Zellen zu vermeiden. Setzen Sie die Dissoziation fort, bis ~ 80% der Zellen dissoziiert sind.
5. Filtrieren Sie die Suspension mit einem sterilen 5 μm Millipore-Filter. Zellsuspensionen müssen filtriert werden, um Zellklumpen, unverdaute Eier und geschlüpfte Larven zu entfernen. Filtern Sie weitere 4-5 ml frisches L-15-Medium durch den Filter, um alle Zellen zurückzugewinnen. Wenden Sie während des Filtrationsschritts keine übermäßige Kraft an, um eine Beschädigung des Filters und/oder der Zellen zu vermeiden.

>2. Zellen kultivieren

1. Pelletieren Sie die dissoziierten Zellen durch Zentrifugation bei 900 x g (~2.500 U/min) für 3 min. Entfernen Sie mit einer P1000-Pipetette und sterilen Spitzen vorsichtig den gesamten Überstand. Resuspendieren Sie die pelletierten Zellen in vollständigem L-15-Medium und einer Platte mit 1 ml/Well. Die Menge des zugegebenen Mediums hängt von der Anzahl der 8P ab die verwendeten Platten, das Zusammentreffen der Würmer auf den Platten und die Art der Experimente, die an den Zellen durchgeführt werden. Die Zelldichte kann mit einem Hämozytometer bestimmt werden. Für Patch-Clamp-Aufzeichnungen ist eine Plattierungsdichte von ~ 230.000 Zellen/^cm2 optimal.
2. Bewahren Sie die 24-Wells-Platte in einem Tupperware-Plastikbehälter mit nassen Papiertüchern auf, um eine Verdunstung des Nährmediums zu vermeiden. Lagern Sie den Behälter in einem befeuchteten Brutschrank bei 20 °C und Umgebungsluft.
3. Die Zellen sind in der Regel innerhalb von 24 Stunden bereit für die Experimente, wenn die morphologische Differenzierung und Expression der GFP-Marker abgeschlossen ist. Die Zellen können bis zu 2 Wochen in Kultur aufbewahrt werden, sind aber in der Regel bis zu 7-9 Tage nach dem Plattieren am gesundesten. Das Medium muss einmal am Tag ausgetauscht werden, um gesunde Zellen zu erhalten.

Ergebnisse

Abbildung 1. C. elegans-Embryonen vor und nach der Chitinase-Behandlung. (A) Foto von Eiern vor der Exposition gegenüber Chitinase. Der Pfeil zeigt auf die durchsichtige und intakte Eischale, die einen Embryo umgibt. (B) Eizellen, die 10 Minuten lang mit Chitinase behandelt wurden. Die Eischalen wurden verdaut und sind um die Embryonen herum ...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
REAGENZIEN
Leibovitz's L-15 Medium (1x) Flüssigkeit	Invitrogen	Artikel-Nr.: 11415-064
Fötales Rinderserum	Invitrogen	Artikel-Nr.: 16140-063
Penicillin-Streptomycin	Sigma	Nr. P4333-100ML
Chitinase aus Streptomyces Griseus	Sigma	C6137-25UN
Erdnuss-Lektin	Sigma	L0881-10MG
AUSRÜSTUNG
101-1000 μl Blaue graduierte Pipettenspitzen	USA Scentific	Tel.: 1111-2821
10 ml sterilisierte Pipette einzeln verpackt	USA Scentific	Tel.: 1071-0810
Ergonomisches variables Volumen (100-1000 μl) Pipettierer mit Spitzenabwerfer	VWR International Inc.	Tel.: 89079-974
Tragbare Pipettierhilfe, Drummond	VWR International Inc.	Tel.: 53498-103
Transfer Kunststoffpipette steril	VWR International Inc.	Nr. 14670-114
15 ml Konisches Röhrchen	USA Scentific	Nr. 1475-1611
Sterile 18 Gauge Nadeln	Becton, Dickinson und Co.	305196
Sterile 10 ml Spritzen	Becton, Dickinson und Co.	305482
Kunststoff-Spritzenfilter Corning 0,20 μm Porengröße	Corning	431224
Akrodischer 25 mm Spritzenvorsatzfilter mit 5 μm Versapor Membran	VWR International Inc.	Artikel-Nr.: 28144-095
60x15 mm Petrischale, steril	VWR International Inc.	Artikel-Nr.: 82050-548
100x15 mm Petrischale, steril	VWR International Inc.	Tel.: 82050-912
12 mm Durchmesser Glas-Deckgläser	VWR International Inc.	Tel.: 48300-560
Klare Zellkulturplatten mit 24-Well-Flachboden und Deckel	Thomas wissenschaftlich	Artikel-Nr.: 6902A09
Dumont #5- Feine Pinzette	Werkzeuge für die Feinwissenschaft	Nr. 11254-20
Zentrifuge 5702	Eppendorf	22629883
Laminar Flow Haube
Inverses Mikroskop mit x10 Objektiv
Befeuchteter Inkubator für Umgebungsluft