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Dieses Protokoll ist ein Auszug aus Tong et al., Microfluidic-based Electrotaxis for On-demand Quantitative Analysis of Caenorhabditis elegans' Locomotion, J. Vis. Exp. (2013).
>1. Elektrotaxis-Experiment
- Platzieren Sie den Mikrokanal auf dem Tisch (vorzugsweise XY-verschiebbar) eines Mikroskops mit einer montierten Kamera, die an einen Monitor angeschlossen ist (Abbildung 1).
- Verbinden Sie die Ausgangsdrähte des Netzteils oder des Verstärkers mit den Elektroden des Mikrokanals. Eine einfache Gleichstromversorgung ist ausreichend, wenn nur ein Gleichstromsignal gewünscht wird, ein Verstärker, der an einen Funktionsgenerator angeschlossen ist, ermöglicht jedoch auch die Anwendung von gepulsten Gleich- und Wechselstromsignalen.
- Befestigen Sie das Ausgangsrohr des Mikrokanals an einer Einwegspritze. Tauchen Sie die Öffnung des Einlassrohrs in physiologischen M9-Puffer und saugen Sie die Flüssigkeit vorsichtig in den Kanal an, indem Sie einen Unterdruck in der Spritze ausüben (entweder manuell oder mit einer Spritzenpumpe). Wenn sowohl der Einlass- als auch der Auslassschlauch mit M9 gefüllt sind, trennen Sie die Spritze vom Schlauch. Nivellieren Sie beide Rohre auf die gleiche Höhe, um eine hydrostatisch angetriebene Strömung zu verhindern.
- Legen Sie eine Gleichspannung an den Kanal an und stellen Sie sicher, dass der Widerstand (R= V/I) etwa 0,6 MΩ beträgt (für einen 50 mm langen, 0,3 mm breiten und ~0,1 mm tiefen Mikrokanal).
- Wenn Sie mit der Integrität des Kanals zufrieden sind, führen Sie die obigen Schritte aus, um Würmer aus einer verdünnten Suspension in den Kanal zu laden.
- Trennen Sie die Spritze und manipulieren Sie den Durchfluss hydrostatisch, indem Sie die relative Höhe der Schläuche einstellen. Verwenden Sie diese Methode, um eine Schnecke in der Mitte des Kanals zu platzieren und dann beide Rohre flach auf der gleichen Höhe zu legen.
- Stellen Sie das Netzteil auf die entsprechende Spannung ein: 4-12 V/cm für L3-Stufentiere, 4-10 V/cm für L4 und 2-4 V/cm für junge Erwachsene. Aktivieren Sie das elektrische Signal und warten Sie 1 Minute Vorbelichtung, damit sich der Wurm an das Feld gewöhnt hat. Der Wurm sollte sich in Richtung Kathode bewegen. Wenn die Minute abgelaufen ist, verwenden Sie die Kamera, um mit der Aufnahme zu beginnen.
- Bei AC- und gepulsten DC-Experimenten kann das maximal ansprechende elektrische Feld von oben übernommen und Frequenz und Tastverhältnis des Signals beliebig moduliert werden.
- Wenn das Experiment beendet ist, entfernen Sie alle Flüssigkeiten (und Würmer) aus dem Kanal, spülen Sie sie mit dH20 aus und lassen Sie das Gerät auf einer heißen Platte bei 125 °C trocknen.
- Extrahieren Sie Bewegungsdaten aus aufgezeichneten Videos manuell mit NIH ImageJ (>http://rsbweb.nih.gov/ij/) oder einer benutzerdefinierten MATLAB-basierten Wurmverfolgungssoftware.
