$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Das folgende Protokoll ist ein Auszug aus Davies et al., Ein Assay zur Messung der Auswirkungen von Ethanol auf die Fortbewegungsgeschwindigkeit von Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2015).
-
Schritte, die am Tag vor dem Assay durchzuführen sind
- Pflücken Sie Würmer im L4-Stadium auf frische Nematoden-Wachstumsmedium (NGM)-Platten, die mit einem Rasen von OP50 E. coli besät sind, und kultivieren Sie sie bei 20 °C O/N. Für jede Assay-Bedingung sind 10 Würmer erforderlich; Wählen Sie einen Überschuss an Würmern, um den O/N-Verlust von Würmern zu ermöglichen.
- Es werden nur Tiere getestet, die am ersten Tag erwachsen sind; viele Mutanten wachsen langsamer als der Wildtyp. Passen Sie den Zeitpunkt der Kommissionierung für Stämme an, die Entwicklungsverzögerungen aufweisen, sodass es sich bei allen getesteten Tieren um adulte Tiere am ersten Tag handelt.
- Schritte, die am Tag des Assays durchzuführen sind
- Vorbereitung für den Assay:
- Durchführung von Assays auf standardmäßigen 60 x 15 mm NGM-Platten ohne Saat. Trocknen Sie alle zu verwendenden Platten 2 Stunden lang bei 37 °C und mit abgenommenen Deckeln. Verwenden Sie für jeden Versuch vier getrocknete NGM-Platten; Dabei handelt es sich um die 0 mM und 400 mM Ethanol-Assay-Platten und die dazugehörigen Akklimatisierungsplatten.
HINWEIS: Die Verwendung von NGM-Platten ist hier wichtig; Unterschiede in der Zusammensetzung der Platten, insbesondere ihre Osmolarität, können die Dosiswirkung von Ethanol auf das Verhalten stark beeinflussen, dies ist zumindest teilweise auf Änderungen in der Menge an Ethanol zurückzuführen, die von den Tieren akkumuliert wird. NGM-Agar hat 160 mOsm.
- Wiegen Sie nach dem Trocknen jede der nicht ausgesäten NGM-Platten, die für den Assay verwendet werden sollen, und notieren Sie das Gewicht. Bestimmen Sie das Medienvolumen in den Platten basierend auf dem Gewicht einer leeren Platte. Um die Umrechnung des Gewichts des Agars in das Volumen zu approximieren, nehmen wir an, dass das Medium das gleiche Gewicht wiegt wie ein gleiches Volumen Wasser.
HINWEIS: Unsere konsistentesten Ergebnisse wurden mit NGM-Medien gefunden, die ausreichend dehydriert sind, so dass ein ursprüngliches Volumen von 10 ml ein Nachtrocknungsvolumen zwischen 8,3 und 8,9 ml hat. Eine Alternative zur 2-stündigen Trocknungszeit besteht darin, zu trocknen, bis die Platten diesen Volumenbereich erreichen, um Unterschiede in den Inkubatoren auszugleichen.
- Schmelzen Sie 4 Kupferringe (Innendurchmesser 1,6 cm) in die Oberfläche jeder der Platten, die als Korallen für die verschiedenen Genotypen oder Behandlungsgruppen von Würmern dienen. Fassen Sie jeden Ring mit einer Pinzette und erhitzen Sie ihn in einer Flamme (eine starke Flamme aus einem Bunsenbrenner eignet sich gut) für ca. 3 Sekunden. Legen Sie den Ring sofort auf eine Platte, während Sie den Ring noch mit der Pinzette festhalten, um ein "Überspringen" zu verhindern.
- Stellen Sie sicher, dass der Ring flach auf der Oberfläche des Agars aufliegt, indem Sie mit der Pinzette an mehreren Stellen des Rings vorsichtig nach unten drücken. Achten Sie beim Platzieren des Rings darauf, Platz für weitere drei Ringe zu lassen.
- Schmelzen Sie die drei zusätzlichen Kupferringe in die Oberfläche der Platte ein und achten Sie darauf, dass sie so nah wie möglich beieinander liegen, so dass sich alle vier im Sichtfeld der Kamera befinden.
HINWEIS: Eine gute Abdichtung mit dem Agar ist wichtig, um die Würmer während des Assays in den Ringen zu halten. Es ist unwahrscheinlich, dass Ringe, die auf der Platte herumspringen, die richtige Abdichtung mit dem Agar herstellen und den Agar vernarben können, was es den Würmern ermöglicht, sich einzugraben und die Visualisierung der Würmer beeinträchtigt.
- Bereiten Sie für jede Assay-Platte eine begleitende "Akklimatisierungsplatte" vor, die getrocknet und unbesät sein sollte und kein Ethanol erhält. Lege vier Kupferringe auf diese Platten.
- Beschriften Sie die Unterseite der Platten neben jedem Ring mit dem Wurmstamm, der im Ring verwendet werden soll, und achten Sie darauf, nicht in das Sichtfeld des Rings selbst zu schreiben. Gleichen Sie die Etiketten auf der Assay-Platte mit der zugehörigen Akklimatisierungsplatte ab.
- Berechnen Sie die Menge an 100 % Ethanol, die jeder Testplatte hinzugefügt werden soll, so dass die Endkonzentration 0 mM oder 400 mM Ethanol (Gewicht zu Volumen) beträgt. Für jedes Experiment (n = 1) gibt es eine 0 mM und eine 400 mM Ethanolplatte; Akklimatisierungsplatten erhalten kein Ethanol. Füge das Ethanol hinzu und pipettiere es über die Oberfläche der Platte. Verwenden Sie Laborfolie, um die Platte zu versiegeln, und lassen Sie sie 2 Stunden lang auf der Tischplatte ausbalancieren.
- Nach Ablauf von 1,5 Stunden beginnen Sie mit dem Akklimatisierungsschritt des Assays, Schritt 2.2.
- Lokomotions-Assay durchführen: Assay-Platten
- Übertragen Sie vorsichtig 10 Würmer jeder Versuchsgruppe in die Mitte eines Kupferrings auf der Akklimatisierungsplatte. Entfernen Sie alle Lebensmittel, die zu diesem Zeitpunkt auf dem Agar sichtbar sind, indem Sie vorsichtig mit dem Wurmstocher kratzen. Variieren Sie die Reihenfolge, in der die Versuchsgruppen in den Versuchsversuchen auf die Platten gelegt werden, so dass nicht dieselben Stämme in allen Versuchen in der gleichen Reihenfolge auf die Platten gelegt werden.
HINWEIS: Ziel ist es, die Tiere mit minimalen Futtermengen auf den Teller zu übertragen, denn wenn das Futter auf der Akklimatisierungsplatte auf die Testplatte übertragen wird, sammeln sich die Würmer um das Futter herum und die Wirkung des Medikaments auf die Fortbewegung wird verschleiert.
- Achten Sie darauf, die Oberfläche des Agars nicht mit dem Plektrum zu brechen, da sich die Würmer sonst eingraben können und der Assay gestört wird. Inkubieren Sie die Würmer 30 Minuten lang bei RT.
- Stellen Sie sicher, dass zwischen den Starts jeder Platte ein angemessenes Intervall liegt. Ein erfahrener Experimentator kann 40 Tiere, 10/Ring für 4 Ringe, in < 1,5 Minuten bewegen, aber jedes Intervall bis zu 2 Minuten ist akzeptabel. Der Standard-Assay umfasst Filmaufnahmen, die bei einer Belichtungszeit von 10-12 Minuten und 30-32 Minuten sowohl für 0 mM als auch für 400 mM Ethanol aufgezeichnet werden.
- Starten Sie die Akklimatisierungsplatte für die 0 mM-Belichtung und die Akklimatisierungsplatte für die 400 mM-Belichtung im Abstand von ca. 2 min und 30 sec, damit die erste Filmdatei gespeichert werden kann, bevor der zweite Film beginnen muss.
- Nach der 30-minütigen Eingewöhnungsphase übertragen Sie die Würmer von den Akklimatisierungsplatten auf die Testplatten. Übertragen Sie die Würmer in der gleichen Reihenfolge, in der sie auf die Akklimatisierungsplatte gegeben wurden, auf die Assay-Platten (0 mM oder 400 mM Ethanol), wobei Sie den Zeitpunkt zwischen den Fertigstellungen jeder Platte im Auge behalten. Versiegeln Sie die Platte mit einer Laborfolie, um den Verlust von Ethanol durch Verdampfung zu minimieren.
- Verwende eine Schaufelbewegung mit einem dünnkantigen, abgeflachten Wurmpickel, um Würmer auf dem abgeflachten Pickel zu sammeln. Führen Sie die Übertragung von Würmern von der unbesäten Akklimatisierungsplatte auf die Testplatte ohne den Einsatz von Bakterien durch, was häufig bei der Übertragung von Würmern verwendet wird, da es hilft, den Wurm an die Spitzhacke zu kleben.
HINWEIS: Die Geschwindigkeit, mit der die Tiere in diesem Schritt übertragen werden, ist sehr wichtig, da die ersten Würmer auf der Platte länger mit Ethanol in Berührung kommen als die letzten Würmer, die auf die Platte gegeben werden, und frühere Zeitpunkte einige zeitabhängige Effekte zeigen können. Dies ist der Hauptgrund für die Rotation, bei der die Stämme zuerst über experimentelle Replikate auf einer Platte platziert werden.
- Lokomotions-Assay durchführen: Filmen
- Verwenden Sie eine Mikroskop-Kamera-Kombination, die die gleichzeitige Abbildung aller vier Ringe im Sichtfeld (ca. 42 x 42 mm2 quadratisch) ermöglicht, z. B. ein 0,5-faches Mikroskopobjektiv mit 0,8-facher Vergrößerung und eine Kamera mit einem 2048 x 2048 7,4 μm Pixel-CCD.
- Verwenden Sie eine gleichmäßige Beleuchtung über das gesamte Sichtfeld, was die Objekterkennung im Intensitätsschwellenwert erleichtert. Eine 3"x3" Hintergrundbeleuchtung funktioniert gut.
- Stellen Sie sich die Würmer auf einer Platte vor, die mit der Medienseite nach oben (Deckel nach unten) positioniert ist, wodurch ein Kontrast erzeugt wird, der bei Verwendung der Hintergrundbeleuchtung im Vergleich zu einer herkömmlichen Durchlichtquelle mit Mikroskop verloren geht.
- Bereiten Sie die Bildanalysesoftware so vor, dass sie Zeitrafferfilme der sich bewegenden Würmer aufnimmt. Stellen Sie die Software so ein, dass 12-Bit-Graustufenbilder alle 1 Sekunde als 2-minütiger Film (120 Bilder) aufgenommen werden. Um die Größe der Ausgabedatei zu reduzieren und gleichzeitig eine ausreichende Bildauflösung beizubehalten, verwenden Sie einen 2x2-Binning-Modus, um Bilder mit 1024 x 1024 Pixeln aufzunehmen.
- Nehmen Sie die Filme auf. Beginnen Sie mit der Aufnahme eines 120-Frame-Films der ersten Platte (0 mM Ethanol) 10 Minuten, nachdem die letzten Würmer auf dieser Platte platziert wurden. Speichern Sie die Filmdatei.
- Nehmen Sie die zweite Platte (400 mM Ethanol) auf. Wiederholen Sie diesen Vorgang für beide Platten, beginnend 30 Minuten, nachdem die letzten Würmer auf die erste Platte (0 mM Ethanol) gelegt wurden, um die Zeitpunkte von 30 bis 32 Minuten für jede Exposition zu erfassen.
HINWEIS: Planen Sie nach jeder Aufnahmesitzung ausreichend Zeit ein, um die Bilddateien zu speichern, bevor Sie mit der Aufzeichnung der nächsten zu analysierenden Platte beginnen.
- Um archivierte Filme zukunftssicher zu machen und das Öffnen und Analysieren dieser Filme mit anderen gemeinfreien Open-Source-Imaging-Softwareprogrammen wie ImageJ zu ermöglichen, konvertieren Sie eine Kopie jedes Films in 8-Bit-TIFF-Dateien mit 256 Graustufen.
HINWEIS: Die hier beschriebene Bildanalysesoftware verwendet ein proprietäres Dateiformat.