Overview
이 비디오는 성인 얼룩말 피시의 등쪽 근육에 화합물을 전달하기위한 근육 주사의 기술을 설명합니다.
Protocol
1. DNA 백신 및 전기 포기의 주입
- 이 프로토콜에 따른 예방 접종의 경우 6개월에서 12개월 된 성인 제브라피쉬를 사용합니다. 14/10h 의 빛/어두운 주기로 물고기를 유동 시스템에 보관하고 1L당 최대 7마리의 물고기를 유지합니다.
- 물고기를 마취하기 위해 탱크 물에 0.02 % 3-aminobenzoic 산 에틸 에스테르 (tricaine) 용액 (pH 7)을 준비합니다. 10cm 페트리 접시 또는 이와 유사한 것을 사용하십시오.
- 깨끗한 시스템 물 3L로 5 L 비커를 채우어 복구 탱크를 준비하십시오.
- 예방 접종 기간 동안 고정 된 위치에 물고기를 유지하기 위해 예방 접종 패딩을 준비합니다. 2~3cm 두께의 스폰지5 x 7cm2조각을 섭취하십시오. 메스 블레이드 또는 날카로운 가위로 홈을 스폰지에 자른다.
참고: 동일한 예방 접종 패딩은 여러 실험에서 사용할 수 있습니다. 70% 에틸 알코올에 담그고 건조하도록 하여 실험 사이에 스폰지를 소독합니다. - 스폰지를 시스템 물에 담그고 페트리 접시에 스폰지를 놓습니다.
- 예방 접종 전에 물고기를 24 시간 빠르게.
- 0.02% 트리카인이 함유된 페트리 접시에 놓아 한 마리의 얼룩말피를 마취합니다. 물고기가 터치 자극에 반응하지 않을 때까지 와 아가미의 움직임이 없을 때까지 기다립니다. 한 번에 하나의 물고기를 마취합니다.
- 플라스틱 숟가락을 사용하여 마취 된 얼룩말 물고기를 젖은 스폰지에 옮기고 물고기의 복부 면을 홈으로 설정합니다. 올바른 위치에서, 머리와 물고기의 몸의 대부분이 홈 내부에 있는지 확인하고 등지느러미와 꼬리가 홈에서 튀어 나와 있는지 확인합니다.
- 현미경의 밑에, 조심스럽게 마이크로 조작기에 x- 및 y 축 미세 조정 바퀴를 사용하여, 제브라피시의 등쪽 근육에 가까운 약 45° 각도에 바늘을 배치합니다.
- 바늘을 밀어 힘이 필요하지 않습니다 등지느러미 앞에 비늘없이 작은 지점을 찾을 수 있습니다. 저항이 느껴지면 인접한 지점을 시도하십시오. 척추, 등지느러미 또는 비늘이 손상되지 않도록 하십시오.
참고: 밀면서 바늘이 구부러지면 바늘을 절단하여 바늘을 약간 줄입니다. - 발 스위치를 사용하여 점차적으로 근육에 백신 용액을 주입하십시오. 현미경을 통해 주사를 관찰 : 페놀 레드는 근육 조직에 들어갈 때 볼 수 있습니다. 필요한 경우 펄스 의 지속 시간을 조정합니다.
참고: 또는, 주입을 위해 공압 펌프의 전면 패널에 펄스 시인터 버튼을 사용한다. 그러나 원격 발 스위치를 사용하면 다른 손으로 10 턴 다이얼 휠로 펄스 길이를 조정할 수 있습니다. 이 과도한 조직 손상을 일으킬 수 있기 때문에 너무 빨리 용액을 주입하지 마십시오. 공기를 주입하지 않도록하십시오. - 주입 직후 물고기를 전기화합니다. 물고기가 아직 마취 하에 있는지 확인하십시오. 스폰지에 물고기를 유지하고 전극이 주입 부위의 양쪽에 위치하도록 트위저 형 전극 사이에 물고기를 설정합니다. 전극 핀셋을 너무 단단히 누르지 말고 두 전극을 물고기와 접촉하십시오.
- 전기포레이터의 시작 버튼을 눌러 6개의 40V, 50ms 펄스를 제공합니다.
- 물고기를 복구 탱크로 부드럽게 옮길 수 있습니다.
- 70% 에탄올로 스 와이프하여 각 전기 포기 후 전극을 청소하십시오.
참고: 예방 접종 후 물고기의 웰빙을 주의 깊게 모니터링하십시오. 0.04% 트리카인에서 불편함(마취, 무산 수영, 헐떡임에서 느린 회복)의 징후를 보이는 물고기를 안락사시합니다. 복구 후, 흐름을 통해 단위로 물고기를 전송하고 정상적으로 공급.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phenol red sodium salt | Sigma-Aldrich | 114537-5G | |
| Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt) | Sigma | A5040-100g | anestesia and euthanasia solution |
| Tweezertrodes Electrodes (7 mm) Kits | BTX Harvard apparatus | BTX 450165 | tweezer type electrodes |
| Aluminosilicate capillaries | Harvard apparatus | 30-0108 | |
| Micromanipulator | Narishige | MA-153 | |
| Microscope | Olympus | ZS61 | |
| ECM Electro Square Porator | BTX Harvard apparatus | BTX ECM 830 | |
| Plastic spoon | |||
| Sponge | |||
| Styrofoam workbench |
