Intramuskuläre (IM) Injektion: Zusammengesetzte Abgabe in den Dorsalmuskel eines erwachsenen Zebrafisches

Overview

Dieses Video beschreibt die Technik der intramuskulären Injektion zur Abgabe von Verbindungen in die Rückenmuskeln eines erwachsenen Zebrafisches.

Protocol

1. Injektion des DNA-Impfstoffs und der Elektroporation

1. Für Impfungen nach diesem Protokoll, verwenden Sie gesunde, 6 bis 12 Monate alte erwachsene Zebrafische. Halten Sie die Fische in einem Durchflusssystem mit einem 14/10 h Licht/Dunkel-Zyklus, mit maximal sieben Fischen pro 1 L Wasser.
2. Bereiten Sie eine 0,02% 3-Aminobenzoesäure-Ethylester (Tricain) Lösung (pH 7) in Tankwasser zur Anästhesisierung der Fische vor. Verwenden Sie eine 10 cm Petrischale oder ähnliches.
3. Bereiten Sie einen Rückgewinnungstank vor, indem Sie einen 5 L Becher mit 3 L sauberem Systemwasser befüllen.
4. Bereiten Sie eine Impfpolsterung vor, um die Fische während der Impfung in einer festen Position zu halten. Nehmen Sie einen 5 x 7 cm² Stück eines 2 bis 3 cm dicken Schwamms. Schneiden Sie eine Nut in den Schwamm mit einer Skalpellklinge oder einer scharfen Schere.
   HINWEIS: Die gleiche Impfpolsterung kann in mehreren Experimenten verwendet werden. Desinfizieren Sie den Schwamm zwischen den Experimenten, indem Sie ihn in 70% Ethylalkohol einweichen und trocknen lassen.
5. Den Schwamm gründlich in das Systemwasser einweichen und den Schwamm auf eine Petrischale stellen.
6. Fasten Sie die Fische 24 h vor den Impfungen.
7. Anästhesisieren Sie einen Zebrafisch, indem Sie ihn auf eine Petrischale legen, die 0,02% Tricain enthält. Warten Sie, bis der Fisch nicht auf Berührungsstimulation reagiert und bis es keine Bewegung der Kiemen gibt. Anästhesisieren Sie einen einzelnen Fisch zu einer Zeit.
8. Mit einem Plastiklöffel den anästhesierten Zebrafisch auf den nassen Schwamm geben und die ventrale Seite des Fisches in die Nut stellen. In der richtigen Position, stellen Sie sicher, dass der Kopf und der größte Teil des Körpers der Fische in der Nut sind und die Rückenflosse und der Schwanz aus der Nut herausragen.
9. Platzieren Sie die Nadel unter dem Mikroskop vorsichtig in einem etwa 45°-Winkel in der Nähe des Rückenmuskels des Zebrafisches, indem Sie die x- und y-Achsen-Feinabstimmungsräder am Mikromanipulator verwenden.
10. Finden Sie den kleinen Fleck ohne Schuppen vor der Rückenflosse, wo das Drücken der Nadel keine Kraft erfordert. Wenn Widerstand zu spüren ist, versuchen Sie es mit einem angrenzenden Punkt. Vermeiden Sie es, die Wirbelsäule, die Rückenflosse oder die Schuppen zu verletzen.
    HINWEIS: Wenn sich die Nadel beim Schieben beugt, kürzen Sie die Nadel leicht, indem Sie sie schneiden.
11. Verwenden Sie den Fußschalter, um die Impfstofflösung schrittweise in den Muskel zu injizieren. Beobachten Sie die Injektion durch das Mikroskop: Phenolrot ist sichtbar, wenn es in das Muskelgewebe gelangt. Passen Sie bei Bedarf die Dauer des Pulses an.
    HINWEIS: Alternativ können Sie den Impulsinitiatorknopf auf der Vorderseite der pneumatischen Pumpe für die Einspritzung verwenden. Die Verwendung eines Fernfußschalters ermöglicht es jedoch, die Pulslänge durch das 10-Dreh-Zifferblatt einzustellen. Vermeiden Sie eine zu schnelle Injektion der Lösung, da dies zu übermäßigen Gewebeschäden führen kann. Achten Sie darauf, keine Luft zu injizieren.
12. Elektroporate den Fisch unmittelbar nach der Injektion. Stellen Sie sicher, dass der Fisch noch unter Anästhesie ist. Halten Sie den Fisch auf dem Schwamm und stellen Sie den Fisch zwischen Pinzetten-Elektroden, so dass die Elektroden auf jeder Seite der Injektionsstelle befinden. Drücken Sie die Elektroden-Pinzette nicht zu eng, sondern halten Sie beide Elektroden in Kontakt mit den Fischen.
    1. Drücken Sie die Starttaste am Elektroporator, um sechs 40 V, 50 ms Impulse zu geben.
    2. Übertragen Sie den Fisch vorsichtig in den Erholungsbehälter.
    3. Reinigen Sie die Elektroden nach jeder Elektroporation, indem Sie sie mit 70% Ethanol wischen.
       HINWEIS: Überwachen Sie das Wohlbefinden der Fische nach der Impfung sorgfältig. Euthanisieren Sie alle Fische, die Anzeichen von Beschwerden zeigen (eine langsame Erholung von der Anästhesie, aberrantes Schwimmen, Gasen) in 0,04% Tricain. Nach der Genesung die Fische auf die Durchflusseinheit übertragen und normal füttern.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phenol red sodium salt	Sigma-Aldrich	114537-5G
Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt)	Sigma	A5040-100g	anestesia and euthanasia solution
Tweezertrodes Electrodes (7 mm) Kits	BTX Harvard apparatus	BTX 450165	tweezer type electrodes
Aluminosilicate capillaries	Harvard apparatus	30-0108
Micromanipulator	Narishige	MA-153
Microscope	Olympus	ZS61
ECM Electro Square Porator	BTX Harvard apparatus	BTX ECM 830
Plastic spoon
Sponge
Styrofoam workbench