Probenvorbereitung für die Metabolomik: Eine Methode zur Vorbereitung von Zellproben für das Metaboliten-Profiling

Abstract

Quelle: Zhao, Y. C. et. al., Systembiologie der Stoffwechselregulation durch Östrogenrezeptor-Signalwege bei Brustkrebs. J. Vis. (2016).

Dieses Video beschreibt eine Technik zur Vorbereitung von Brustkrebszellproben für die Erstellung von Metabolitenprofilen. Brustkrebszellen werden mit Östradiol behandelt, das an den Östrogenrezeptor alpha bindet und eine Veränderung der Metabolitenzusammensetzung bewirkt.

Protocol

1. Probenvorbereitung für Metabolomics-Assays

1. Zellkultur und -behandlung
   1. Aussaat von 400.000 MCF7-Zellen pro 10 cm Platte im Wachstumsmedium. Bereiten Sie für jede Behandlung drei Proben vor. Verwenden Sie zwei Platten in jeder Probe, um genügend Zellen für den Nachweis zu erhalten. Entfernen Sie an Tag 3 das Medium und geben Sie 5 ml frisches Medium mit oder ohne ^10-8 M Östradiol oder E2 zu den Zellen. Behandeln Sie die Zellen 24 Stunden lang (37 °C in befeuchteter Atmosphäre mit 5 % CO₂
   ).
2. Musterkollektion
   1. 5 ml eiskaltes 1x PBS auf die Platte geben, nach mehrmaligem kurzen Kippen der Platte das PBS ansaugen. Wiederholen Sie dies zweimal und entfernen Sie nach der letzten Wäsche so viel PBS wie möglich.
   2. Geben Sie 750 μl kaltes Aceton auf jede Platte und kratzen Sie die Zellen ab. Kombinieren Sie die Zellen in Aceton aus zwei Platten in einer 2 ml Tube auf Eis.
   3. Zellzahl für die Normalisierung
      1. Verwenden Sie für jede Behandlung zwei zusätzliche Platten zur Zellquantifizierung. Um die Zellen von der Platte zu lösen, geben Sie 2 ml HE-Puffer (1x HBSS, 10 mM HEPES, 0,075 % NaHCO₃ und 1 mM EDTA) in jede Platte und inkubieren Sie sie 5 Minuten lang.
      2. Sammeln und mischen Sie die Zellen gut, indem Sie die Zellen in den HE-Puffer pipettieren. Verwenden Sie insgesamt 20 μl Zelllösung, um die Zellzahl mit einem Hämozytometer zu zählen.
3. Lagern Sie die Proben bei -80 °C, bevor Sie sie an das Metabolomics-Zentrum senden, um die Metaboliten mittels Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS) zu identifizieren und zu quantifizieren.