Vergleichende In vivo Studium der gp96 Adjuvantizität in the Frog Xenopus laevis</em

Zusammenfassung

Der Frosch Xenopus laevis Bietet eine attraktive Alternative Nicht-Säuger-Modell für die Erkundung der Fähigkeit des Hitzeschock-Proteins, wie gp96, Antigen-spezifische CD8 T-Zell-Reaktionen zu fördern. Wir präsentieren Methoden zur Untersuchung In vivo Erleichterung der Cross-Präsentation von Haut-und Tumor-Antigene von gp96.

Zusammenfassung

Wir haben in den Amphibien Xenopus laevis entwickelt eine einzigartige Nicht-Säuger-Modell, um die Fähigkeit bestimmter Hitzeschockproteine ​​(HSP), wie gp96, um Cross-Präsentation von Antigenen beaufsichtigt zu erleichtern und zu entlocken angeborenen und erworbenen T-Zell-Antworten. Xenopus Haut Abstoßungsreaktion Studie bietet eine hervorragende Plattform, um die Fähigkeit des gp96 zu den klassischen MHC-Klasse-Ia (Klasse Ia) eingeschränkte T-Zell-Reaktionen zu entlocken zu studieren. Darüber hinaus die Xenopus-Modell-System bietet auch eine attraktive Alternative zu Mäusen für die Erkundung der Möglichkeit von gp96 zu Reaktionen gegen Tumore, die haben ihre Klasse Ia-Moleküle herunter reguliert dadurch entkommen Immunüberwachung generieren. Kürzlich haben wir ein Adoptiv-Zell-Transfer-Assay in Xenopus-Klone mit peritonealen Leukozyten Antigen-präsentierende Zellen (APC) entwickelt und gezeigt, dass gp96 kann prime CD8 T-Zell-Antworten in vivo gegen Nebenhistokompatibilitätsantigene Haut-Antigene als auch gegen die Xenopus Thymus Tumor 15 / 0, die nicht zum Ausdruck bringt Klasse Ia-Moleküle. Wir beschreiben hier die Methodik einbezogen, um diese Tests, einschließlich der Erhebung, pulsierende und adoptiven Transfer von peritonealen Leukozyten, sowie die Hauttransplantation und Tumortransplantation Assays durchzuführen. Darüber hinaus sind wir auch beschreiben, die Ernte und die Trennung von peripheren Blut Leukozyten für die Durchflusszytometrie und Proliferation Assays, die zur weiteren Charakterisierung der Effektor-Populationen in der Haut Ablehnung und Anti-Tumor-Reaktionen beteiligt ermöglichen eingesetzt.

Protokoll

1. Animals

X. laevis x X. Gilli Hybriden LG-6 und LG-15 isogenetischen Klone ¹ sind aus unserer Zucht Kolonie an der University of Rochester (http://www.urmc.rochester.edu/smd/mbi/xenopus/index.htm). LG-6 und LG-15 teilen sich die gleiche heterozygote MHC-Haplotyp (a / c) unterscheiden sich aber in Nebenhistokompatibilitätsantigene (H) loci. Progeny aus diesen Klonen von Gynogenese hergestellt, bei denen diploiden Eier vom Weibchen produziert von UV-bestrahlten Spermien (keine DNA Beitrag an die Nachkommen) aktiviert werden.

Das Tragen von Handschuhen ist fakultativ. Einige Leute ziehen es nicht tragen, weil es schwieriger ist, die Frösche Griff (rutschig) und in der Tat scheint es, um die Frösche unbequem.

2. Reinigung von gp96 aus 15 / 0 Tumor (bekundet Beide Tumor-und Minor H-AGs)

Gp96 Reinigung wurde bereits ^{2, 3} beschrieben. Kurz gesagt, ist gp96 um 50-70% Ammoniumsulfat-Fraktionierung, durch ConA-Sepharose und DEAE-Chromatographie gereinigt. Etwa 20-50 pg Protein kann pro 1 mL des Tumorgewebes erreicht werden. Reinheit des Präparates wird durch SDS-PAGE und Splitter-Färbung bestimmt.

3. Erhebung und Harvest of Peritoneal Leukozyten (PLS) von Minor H-Ag-disparate LG-6 Frogs

1. Wachsen einer 25 ml Übernachtkultur E. Coli-Kultur in einer 50 ml konischen Rohr bei 37 ° C unter Schütteln.
2. Am nächsten Tag Hitze tötet die Bakterien durch Kochen für 1 Stunde.
3. Centrifuge die Hitze getötet E. Coli für 15 min bei 2.000 rpm (1.500 g) bei 4 ° C.
4. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Bakterienpellet in 1 / 10 ^th der ursprünglichen Kultur Volumen (2,5 ml) in APBS. An diesem Punkt der Bakterienkultur ist gebrauchsfertig und muss innerhalb von 24 Stunden verwendet werden.
5. Inject intraperitoneal (ip) 200 (für ein 2-Zoll-Frosch) oder 300 ul (für ein 3-Zoll-Frosch) der durch Hitze abgetöteten Bakterien Vorbereitung pro Frosch mit einer 25-Gauge-5 / 8 Nadel.
6. Drei Tage nach der Injektion PLs werden durch intraperitoneale Lavage geerntet.
7. Vor PL Ernte, sind erwachsene Frösche betäubt durch Eintauchen in eine 0,1% ige wässrige Lösung von Tricaine Methansulfonat (TMS, MS-222) mit Natriumbicarbonat für bis zu 5 min zwischengespeichert werden, bis alle Bewegungen aufhört (Dauer hängt von Größe und Alter). Tiere erwachen innerhalb von 10-20 min nach der Behandlung.
8. Desinfizieren Sie den Bauch des Frosches mit einer kleinen Menge von 70% Ethanol.
9. Inject 5 mL (bei einem 2-Zoll-Frosch) oder 10 ml (für einen 3-Zoll-Frosch) von sterilen APBS bei Raumtemperatur in die Bauchhöhle mit einer 18-Gauge-Nadel 1 ½ vorgewärmt. Entfernen Sie die Nadel und sanft einmassieren der Frosch für eine Minute, um sicherzustellen, dass das injizierte Puffer mit der Flüssigkeit in die Körperhöhle ausgleicht.
10. Verwenden Sie eine neue 18-Gauge-Nadel 1 ½ ohne eine Spritze, die Peritonealflüssigkeit, dass von der Rückseite der Nadel in einem sauberen 50 mL konischen Rohr tropft sammeln. Achten Sie darauf, wie viel von der ursprünglichen injizierte Volumen wie möglich zu erhalten. Achten Sie darauf, die Blutgefäße im zentralen Bereich der Bauchregion zu vermeiden.
11. Sobald PLs geerntet setzen den Frosch in einen Behälter mit flachem Wasser, bis er wach ist, an welcher Stelle es zurück in seinen Käfig gelegt werden.

4. Pulsing und adoptiven Transfer von Lg-6 Pls in naive Lg-6 Empfänger

1. Waschen Sie die PLs einmal mit kaltem APBS und Zentrifuge sie bei 1.000 rpm (750 g) für 10 min bei 4 ° C.
2. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das PLs in APBS.
3. Pulse des PLS mit gp96 bei einer Konzentration von 1 ug gp96 pro 5 x 10 ⁵ PLS.
4. Sobald der entsprechende Betrag von gp96 an das PLS hinzugefügt wird, mischen sie durch Pipettieren und auf Eis inkubieren für 1 Stunde.
5. Zentrifugieren Sie die Zellen entweder bei 1.000 rpm für 10 min bei 4 ° C oder bei 14.000 rpm für 1 min, um alle ungebundenen gp96 zu entfernen.
6. Waschen Sie die PLs 3X mit kaltem APBS, um sicherzustellen, gibt es keinen Rest-gp96 links.
7. Resuspendieren der gepulsten PLs bei einer Konzentration von 5 x 10 ⁵ PLs pro 300 ul.
8. Adoptiv Transfer PLs durch ip-Injektion mit 25-Gauge-5 / 8 Nadel. Inject 300 ul gepulsten PLs (5 x 10 ⁵ Zellen) pro Tier.
9. Frösche müssen grundiert mindestens 3 Tage, bevor Sie mit Hauttransplantation oder Tumor Herausforderung Experimente.

5. Skin Graft Assay

Haut-Transplantat-Abstoßung ist eine gut etablierte Assay in Xenopus ^{4, 5, 6.} In Xenopus, lehnt einen Empfänger Spenderhaut Anzeige 1 oder 2 MHC Haplotyp Fehlanpassungen innerhalb 18-22 Tage bei 21-22 ° C. Im Gegensatz dazu sind Hauttransplantationen zwischen LG-6 und LG-15-Klone, die sich nur durch kleinere H-Ags langsamer (mehr als 30 Tage) abgelehnt. Allerdings ist diese Ablehnung in Empfängern tha beschleunigtt gegen Spender kleinere H-Ags entweder durch eine frühere Hauttransplantation oder durch Immunisierung mit gp96 vom Spender gereinigt grundiert. Keine Ablehnung überhaupt auftritt, wenn der Spender und Empfänger genetisch identisch (z. B., geklont oder vollständig Inzucht Tiere) sind. Daher ist diese einfache Technik sehr mächtig zur Charakterisierung in vivo Immunantwort, die durch gp96.

1. Anesthetize Spender Frosch als in 3.7 beschrieben.
   Hinweis: Nur minimale Vorsichtsmaßnahmen ergriffen werden müssen, da Xenopus potente antimikrobielle Peptide (zB Magainin) produzieren in der Haut, die die Notwendigkeit für die gesamte aseptischen Verfahren vermeidet. In der Tat würde die Behandlung des Frosches mit einem Desinfektionsmittel schädlich sein für die Haut. Hinzu kommt, dass Xenopus keine Krankheitserreger, die auf den Menschen übertragen werden können. Daher ist die Verwendung von Handschuhen optional. Allerdings müssen alle die Präparation verwendeten Instrumente sterilisiert werden und alle Lösungen müssen steril sein.
2. Ausschneiden und Entfernen eines kleinen (20 mm X 5 mm) Stück Bauchhaut (Bauchhaut, die silbrig durch das Vorhandensein von irridophore pigmentierten Zellen erscheint) aus einem LG-15 Spender Frosch mit einer Schere.
3. Legen Sie die Haut in einer Petrischale mit APBS und bewahren Sie es auf Eis. Bearbeiten Sie die Hautgewebe sehr sanft; vermeiden halten es zwischen Zange.
4. Mit einer Rasierklinge oder einer Schere geschnitten einzelnen Transplantate in 5 mm X 5 mm Stücke. Halten Sie die Fragmente in APBS auf Eis.
5. An diesem Punkt des Spenders Frosch wird in einem Behälter mit flachem Wasser gelegt, bis es wach und dann ist es in Wasser mit Antibiotika (Penstrep bei einer Konzentration von 5 mg / L) gelegt wird. Der Frosch wird in Wasser mit Antibiotika für zwei Tage, an welcher Stelle es in normales Wasser zurück gehalten. Die kleine Wunde an der Stelle, wo die Haut entfernt wurde muss nicht genäht werden und heilt innerhalb einer Woche.
6. Anesthetize der Empfänger LG-6 Frosch.
7. Machen Sie einen kleinen Einschnitt auf der dorsalen (hinteren) Haut des Empfängers ein und legen Sie die 5 mm X 5 mm Transplantat unter der Haut mit der silbernen Seite nach oben. Achten Sie darauf, große Luftblasen unter der Haut führen, weil das gegen Verschiebung oder sogar zum Verlust des Transplantats führen kann.
8. Stellen Sie sicher, beachten Sie die Schere und Pinzette Markierungen auf der Transplantate, weil diese nicht als Transplantat-Abstoßung gezählt werden, wenn die Scoring beginnt.
9. 24 Stunden später ein Teil der Überlagerung Host Haut braucht, um aus dem Transplantat entfernt werden.
10. Anesthetize der Empfänger LG-6 Frosch. Behandeln Sie das Tier wie unter 5.1 beschrieben.
11. Mit autoklaviert Schere schneiden Sie ein Fenster um das Transplantat so dass das Transplantat kann frei visualisiert. Achten Sie darauf, den Spender Haut berühren oder zu Blutungen zu induzieren. Lassen Sie den Frosch wieder wie in 5.5 beschrieben.
12. Starten Scoring das Transplantat sofort, indem sie eine Skizze. Haut-Transplantat-Abstoßung wird durch den Prozentsatz der Zerstörung der irridophores auf der transplantierten Haut bestimmt.
13. Die Transplantate müssen überprüft alle 2-3 Tage, aber die Tiere müssen nicht betäubt werden für diese. Zur Visualisierung der Transplantate, müssen die Frösche in einer Petrischale unter einem Binokular platziert werden.

6. Whole-mount Immunhistologie von transplantierten Haut

Frog ganzen-mount Immunhistologie wurde bereits ⁶ beschrieben. Kurz gesagt, ist der Frosch betäubt und unter dem Mikroskop auf einem sterilen Papiertuch vornässen mit Frosch Wasser (Arbeitsbereich ist auch aseptisch vorbereitet). Das transplantierte Haut wird dann zusammen mit einer kleinen Menge der umgebenden Haut Host geerntet und es ist mit Antikörpern ähnlich Zellfärbung für die Durchflusszytometrie Analyse ^6. gefärbt. Autoklaviert Instrumente und sterile Puffer verwendet werden müssen. Nach der Färbung der Haut befindet sich auf einem Objektträger gebracht und vorsichtig mit einem Deckglas gedrückt. An diesem Punkt kann die Haut sichtbar gemacht werden mit einem Fluoreszenz-Mikroskop für unterschiedliche Zellpopulationen, dass das Transplantat infiltriert haben. Nach dem Eingriff der Frosch wird in Wasser mit Antibiotika gehalten, wie in Abschnitt 5.5 beschrieben. und in normalem Wasser zurückgegeben. Die kleine Wunde links, wo die Haut wurde entfernt heilt innerhalb einer Woche.

7. Charakterisierung von Leukozyten

1. Bevor Sie das Blut aus der Frosch, muss man "Glasnadeln", indem sterile Pasteur Pipetten über Flamme vorzubereiten. Die feine Spitze der Pipette wird unter dem Stereomikroskop geschärft. Die Pipette wird dann zu einer Aspiration Kunststoffschlauch verbunden.
   Alle Instrumente wie Zangen und Scheren müssen vor dem Einsatz autoklaviert werden.
2. Auch vorzubereiten eiskalter 10 ml APBS und Heparin-Lösung durch Zugabe von 50 Einheiten Heparin pro 1 ml APBS. Keep-Lösung auf Eis. Alle verwendeten Lösungen müssen steril sein.
3. Anesthetize Frosch als in 3.7 beschrieben, und folgen Sie dem gleichen Tier Handhabung wie in 5.1 beschrieben. .
4. Schneiden Sie die Haut über dem hinteren Fuß zu setzender dorsalen Tarsus Vene.
5. Füllen Sie die Pasteurpipette mit 1-2 ml APBS + Heparin-Lösung.
6. Legen Sie die "gläserne Nadel" in die Vene und sammeln das Blut durch langsames Ansaugen mit dem Mund. Es ist wichtig, APBS + Heparin-Lösung in die "gläserne Nadel" haben, da diese die Blutgerinnung und das Verstopfen der Spitze der Nadel zu verhindern.
7. 1 bis 2 ml Blut kann von einer durchschnittlich großen Frosch erreicht werden.
8. Die kleinen Schnitt am Froschschenkel muss nicht genäht werden und die Wunde heilt innerhalb einer Woche.
9. Zentrifuge das Blut bei 1.000 rpm für 10 min bei 4 ° C.
10. Entfernen Sie den Überstand und die Zellen 1x mit 10 ml kaltem APBS.
11. Overlay 2 ml Blut (1-5 x 10 ⁶ Zellen) auf 1 ml Ficoll Histopaque 1,077 (Sigma) bei Raumtemperatur vorgewärmt, um das Blut Leukozyten aus den roten Blutkörperchen zu trennen.
12. Zentrifuge 20 min bei 1.000 rpm bei Raumtemperatur ohne Bremse, und dann sammeln die Leukozyten-Band.
13. Waschen Sie die Zellen 2X mit APBS durch Zentrifugation bei 1.400 rpm für 10 min bei 4 ° C zur Entfernung des Rest-Ficoll.
14. An dieser Stelle werden die Zellen bereit, mit Antikörpern für die Durchflusszytometrie-Analyse gefärbt werden, zu nutzen oder für in-vitro-Kultur-Assays werden.

8. Tumor Transplantation Assay

1. Etwa eine Woche vor dem Experiment auftauen eine neue Charge von 15 / 0 Tumorzellen und stellen Sie sicher, dass die Zellen gut wachsen beginnen. Kulturmedium ist kurz und bündig in den nächsten Abschnitt und im Detail in ³ beschrieben.
2. Erweitern Sie die 15 / 0 Tumorzellen.
3. Am Tag des Experiments, zählen Sie die Zellen und bestimmen Zelltod durch Trypanblau-Ausschluss. Tote Zellen weniger als 5% betragen. Wash-Zellen 1X in kalten APBS und Zentrifuge bei 1.000 rpm bei 4 ° C für 10 min.
4. Resuspendieren der Zellen in Tumorzellen Kulturmedium in einer Dichte von 5 x 10 ⁵ 15 / 0 Zellen pro 300 ul.
5. Transplant 5 x 10 ⁵ Zellen in 300 ul Volumen pro Frosch durch subkutane Injektion mit einer 25-Gauge-5 / 8 Nadel auf einer Seite des dorsalen (hinteren) Seite des Tieres.
6. Das Tumorwachstum wird innerhalb von 2-3 Wochen nach der Tumor-Challenge zu starten. Die ursprünglichen Tumor Aussehen zu beachten und das Tumorvolumen muss erfasst alle 2-3 Tage. Tumorvolumen (Höhe x Länge x Breite) wird unter Verwendung von Bremssätteln.
7. Sobald der Tumor wächst auf 3.500 mm ³ oder der Frosch beginnt mit der Suche lethargisch, muss er eingeschläfert werden, um Beschwerden zu vermeiden.

9. Benötigten Reagenzien:

• Amphibian Phosphate Buffered Saline (APBS): 6,6 g / L NaCl, 1,15 g / L Na ₂ HPO _4, 0,2 g / L KH ₂ PO. pH auf 7,5 mit 10N NaOH und filtriert durch 0,2 um-Filter sterilisiert.
• Tricaine Methansulfonat (TMS, MS-222) (Crescent Research Chemicals CAS # 886-86-2).
• Natriumbicarbonat (Fisher Scientific S-233 bis 500).
• Histopaque-1077 (Sigma-Aldrich 10771-100 ml)
• Heparin Sodium Salt (Sigma-Aldrich H3149-50KU)
• Kulturmedium für Xenopus 15 / 0 Tumoren [siehe 3 für weitere details]: 1 L Iscove DMEM Basalmedium (Gibco-Invitrogen 11965) mit 10 ml Insulin, 10 ml nicht-essentiellen Aminosäuren, 10 ml Penicillin-Streptomycin; 10 ug / ml Kanamycin, 3 ml Primatone (Sheffield Products Division), 1 ml der β2-Mercaptoethanol und 3,02 g NaHCO ₃ in Wasser (pH 7,0). Dieses Medium ist, um Amphibien Osmolarität durch Zugabe von 30% doppelt destilliertem Wasser verdünnt, und ergänzt mit 5% fötalem Rinderserum, 20% superantant aus einer Xenopus Nierenzellinie A6 und 0,25% der normalen Xenopus Serum.

10. Repräsentative Ergebnisse

Abbildung 1. Stereomikroskopische Analyse der Haut Abstoßung 12 Tage nach der Transplantation. LG-6 geklont Frosch erhielt eine Hauttransplantation entweder (A) eine MHC-identischen LG-6 (zeigt keine Ablehnung) oder (B) eine MHC-disparate outbred Spender (80% Ablehnung). Arrows zeigt silbrige iridophore pigmentierten Zellen Kennzeichnung gesunde (nicht abgelehnt) veredelt Gewebe. (*) Mark der Zange nicht auf Ablehnung.

Abbildung 2. Gp96 erleichtert Cross-Präsentation von Tumor-Antigenen in Xenopus. LG-15 PL (5 x 10 ⁵⁾ wurden für 1 Stunde auf Eis entweder mit APBS (negative Kontrolle), 1 ug von rekombinanten gp96 aus einem E. gereinigt gepulsten Coli-Kultur, oder 1 oder 0,5 ug gp96 aus 15 / 0 Tumorgewebe gereinigt. Nach 3 Waschungen wurden die Zellen adoptiv in LG-15 erwachsene Empfänger übertragen (1 x 10 ⁶ / Person). Drei Tage später, leben 15 / 0 Tumorzellen (5 x 10 ⁵⁾ wurdentransplantiert durch sc Injektion. Jede Kurve stellt die Kinetik des Tumorwachstums in einen Frosch. Tage nach der Belastung, wenn Tumoren erschien erstmals überwacht wurden, und die Tumorgröße wurde regelmäßig mit einem Bremssattel (Länge x Breite x Dicke) ermittelt.

Diskussion

Die Amphibien Xenopus ist eine einzigartige vielseitige Nicht-Säuger-Modell, um Immunität zu studieren. Seine umfangreichen Einsatz in der biomedizinischen und immunologischen Forschung hat in vielen wichtigen Forschungs-Tools wie der MHC definierten Klone LG-6 und LG-15 sowie verschiedene Zelllinien und monoklonalen Antikörpern ergab. Mit Hilfe dieser Werkzeuge, die wir gegründet haben verschiedene in vitro und in vivo-Tests, die Fähigkeit der Hitzeschock-Proteine ​​wie gp96 potente Ag-spezif...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Benötigte Reagenzien:
Amphibien-Phosphatpuffer (APBS):
NaCl, 1,15 g/L
Na2HPO4, 0,2 g/L
KH2PO
10N NaOH
Tricain-Methansulfonat (TMS, MS-222)	Crescent Research Chemicals	CAS#886-86-2
Natriumbicarbonat	Fisher Scientific	S-233-500
Histopaque-1077	Sigma-Aldrich	10771	100 ml
Heparin-Natriumsalz	Sigma-Aldrich	H3149-50KU
Kulturmedium für Xenopus-15/0-Tumore [siehe 3 für weitere Einzelheiten]:
Iscove DMEM-Basalmedium	GIBCO, von Life Technologies	11965
Insulin
Nicht-essentielle Aminosäuren
Penicillin-Streptomycin
Kanamycin
Primatone	Sheffield Products Division
β2-Mercapto–ethanol
NaHCO3
30 % zweifach destilliertes Wasser
5 % fötales Rinderserum
20 % Überstand aus einer Xenopus-Nierenzelllinie A6
0,25 % normales Xenopus-Serum
Materialien und Geräte:
Kegelförmige Zentrifugenröhrchen, 50 und 15 ml (steril)
Sterile 25-Gauge-5/8-Precision-Glide-Nadeln	BD Biosciences
Sterile 18-Gauge-1½-Precision-Glide-Nadeln	BD Biosciences
Sterile 1-ml-Tuberkulinspritze mit Slip-Tip	BD Biosciences
Sterile 10-ml-Spritze mit Slip-Tip	BD Biosciences
1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen (steril)
Sterile Polystyrol-Petri-Schalen, 60 × 15 mm	Falcon BD
Rasierklingen
25 × 75 mm × 1 mm Premium-Mikroskopobjektträger	Fisher Scientific
10-cm-Glas-Petri-Schalen
9" Pasteur-Pipetten aus Durex-Borosilikatglas, mit Watte verschlossen, Einweg	VWR international
Tygon-Schlauch
Zwei Nr. 5 Schweizer Uhrmacher’s-Pinzetten	Miltex Inc.
Mikro-dissezierende Feder-Scheren McPherson-Vannas, gerade Schneidkante, 6 mm	Roboz Surgical Instruments Co.
Helios-Schublehre
Präparationsmikroskop
Hochleuchtstofflampe
Blutkörperchenzähler (Hämozytometer)
Unbunsen-Brenner
37°C-Schüttelinkubator
Zentrifuge