Der Frosch Xenopus laevis Bietet eine attraktive Alternative Nicht-Säuger-Modell für die Erkundung der Fähigkeit des Hitzeschock-Proteins, wie gp96, Antigen-spezifische CD8 T-Zell-Reaktionen zu fördern. Wir präsentieren Methoden zur Untersuchung In vivo Erleichterung der Cross-Präsentation von Haut-und Tumor-Antigene von gp96.
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Methodenartikel
Vergleichende In vivo Studium der gp96 Adjuvantizität in the Frog Xenopus laevis
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Wir haben in den Amphibien Xenopus laevis entwickelt eine einzigartige Nicht-Säuger-Modell, um die Fähigkeit bestimmter Hitzeschockproteine (HSP), wie gp96, um Cross-Präsentation von Antigenen beaufsichtigt zu erleichtern und zu entlocken angeborenen und erworbenen T-Zell-Antworten. Xenopus Haut Abstoßungsreaktion Studie bietet eine hervorragende Plattform, um die Fähigkeit des gp96 zu den klassischen MHC-Klasse-Ia (Klasse Ia) eingeschränkte T-Zell-Reaktionen zu entlocken zu studieren. Darüber hinaus die Xenopus-Modell-System bietet auch eine attraktive Alternative zu Mäusen für die Erkundung der Möglichkeit von gp96 zu Reaktionen gegen Tumore, die haben ihre Klasse Ia-Moleküle herunter reguliert dadurch entkommen Immunüberwachung generieren. Kürzlich haben wir ein Adoptiv-Zell-Transfer-Assay in Xenopus-Klone mit peritonealen Leukozyten Antigen-präsentierende Zellen (APC) entwickelt und gezeigt, dass gp96 kann prime CD8 T-Zell-Antworten in vivo gegen Nebenhistokompatibilitätsantigene Haut-Antigene als auch gegen die Xenopus Thymus Tumor 15 / 0, die nicht zum Ausdruck bringt Klasse Ia-Moleküle. Wir beschreiben hier die Methodik einbezogen, um diese Tests, einschließlich der Erhebung, pulsierende und adoptiven Transfer von peritonealen Leukozyten, sowie die Hauttransplantation und Tumortransplantation Assays durchzuführen. Darüber hinaus sind wir auch beschreiben, die Ernte und die Trennung von peripheren Blut Leukozyten für die Durchflusszytometrie und Proliferation Assays, die zur weiteren Charakterisierung der Effektor-Populationen in der Haut Ablehnung und Anti-Tumor-Reaktionen beteiligt ermöglichen eingesetzt.
Protokoll
1. Animals
X. laevis x X. Gilli Hybriden LG-6 und LG-15 isogenetischen Klone 1 sind aus unserer Zucht Kolonie an der University of Rochester (http://www.urmc.rochester.edu/smd/mbi/xenopus/index.htm). LG-6 und LG-15 teilen sich die gleiche heterozygote MHC-Haplotyp (a / c) unterscheiden sich aber in Nebenhistokompatibilitätsantigene (H) loci. Progeny aus diesen Klonen von Gynogenese hergestellt, bei denen diploiden Eier vom Weibchen produziert von UV-bestrahlten Spermien (keine DNA Beitrag an die Nachkommen) aktiviert werden.
Das Tragen von Handschuhen ist fakultativ. Einige Leute zie....
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Diskussion
Die Amphibien Xenopus ist eine einzigartige vielseitige Nicht-Säuger-Modell, um Immunität zu studieren. Seine umfangreichen Einsatz in der biomedizinischen und immunologischen Forschung hat in vielen wichtigen Forschungs-Tools wie der MHC definierten Klone LG-6 und LG-15 sowie verschiedene Zelllinien und monoklonalen Antikörpern ergab. Mit Hilfe dieser Werkzeuge, die wir gegründet haben verschiedene in vitro und in vivo-Tests, die Fähigkeit der Hitzeschock-Proteine wie gp96 potente Ag-spezif.......
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Offenlegungen
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Danksagungen
Der Experte der Tierhaltung durch Tina Martin und David Albright vorgesehen ist, dankbar zu schätzen. Diese Arbeit wurde durch Fördermittel T32-AI-07285 (HN), NIH R25 2GM064133 (TCL), 1R03-HD061671-01, R24-AI-059830-06 vom NIH gefördert.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Benötigte Reagenzien: | |||
| Amphibien-Phosphatpuffer (APBS): | |||
| NaCl, 1,15 g/L | |||
| Na2HPO4, 0,2 g/L | |||
| KH2PO | |||
| 10N NaOH | |||
| Tricain-Methansulfonat (TMS, MS-222) | Crescent Research Chemicals | CAS#886-86-2 | |
| Natriumbicarbonat | Fisher Scientific | S-233-500 | |
| Histopaque-1077 | Sigma-Aldrich | 10771 | 100 ml |
| Heparin-Natriumsalz | Sigma-Aldrich | H3149-50KU | |
| Kulturmedium für Xenopus-15/0-Tumore [siehe 3 für weitere Einzelheiten]: | |||
| Iscove DMEM-Basalmedium | GIBCO, von Life Technologies | 11965 | |
| Insulin | |||
| Nicht-essentielle Aminosäuren | |||
| Penicillin-Streptomycin | |||
| Kanamycin | |||
| Primatone | Sheffield Products Division | ||
| β2-Mercapto–ethanol | |||
| NaHCO3 | |||
| 30 % zweifach destilliertes Wasser | |||
| 5 % fötales Rinderserum | |||
| 20 % Überstand aus einer Xenopus-Nierenzelllinie A6 | |||
| 0,25 % normales Xenopus-Serum | |||
| Materialien und Geräte: | |||
| Kegelförmige Zentrifugenröhrchen, 50 und 15 ml (steril) | |||
| Sterile 25-Gauge-5/8-Precision-Glide-Nadeln | BD Biosciences | ||
| Sterile 18-Gauge-1½-Precision-Glide-Nadeln | BD Biosciences | ||
| Sterile 1-ml-Tuberkulinspritze mit Slip-Tip | BD Biosciences | ||
| Sterile 10-ml-Spritze mit Slip-Tip | BD Biosciences | ||
| 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen (steril) | |||
| Sterile Polystyrol-Petri-Schalen, 60 × 15 mm | Falcon BD | ||
| Rasierklingen | |||
| 25 × 75 mm × 1 mm Premium-Mikroskopobjektträger | Fisher Scientific | ||
| 10-cm-Glas-Petri-Schalen | |||
| 9" Pasteur-Pipetten aus Durex-Borosilikatglas, mit Watte verschlossen, Einweg | VWR international | ||
| Tygon-Schlauch | |||
| Zwei Nr. 5 Schweizer Uhrmacher’s-Pinzetten | Miltex Inc. | ||
| Mikro-dissezierende Feder-Scheren McPherson-Vannas, gerade Schneidkante, 6 mm | Roboz Surgical Instruments Co. | ||
| Helios-Schublehre | |||
| Präparationsmikroskop | |||
| Hochleuchtstofflampe | |||
| Blutkörperchenzähler (Hämozytometer) | |||
| Unbunsen-Brenner | |||
| 37°C-Schüttelinkubator | |||
| Zentrifuge |
Referenzen
- Kobel, H. R., Pasquier, D. u, L, Hyperdiploid species hybrids for gene mapping in Xenopus. Nature. 279, 157-158 (1979).
- Robert, J., Menoret, A., Basu, S., Cohen, N., Srivastava, P. R. Phylogenetic conservation of the molecular and immunological properties of the....
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Nachdrucke und Genehmigungen
