Phosphatase-Assay in Darmkrebszellen: Eine Methode zur Untersuchung des Phosphorylierungsstatus des Tau-Proteins in Darmkrebszellen

Zusammenfassung

Quelle: Huda, M. N., et al. Assay für Phosphorylierung und Mikrotubuli-Bindung zusammen mit der Lokalisierung des Tau-Proteins in Darmkrebszellen. J. Vis. Exp. (2017)

Dieses Video beschreibt ein Protokoll zur Beurteilung des Phosphorylierungsstatus des Tau-Proteins durch einen Phosphatase-Assay in Darmkrebszellen. Das Phosphatase-Enzym wirkt auf die auf dem Tau-Protein vorhandenen Phosphatgruppen und erhöht die Mobilität des Tau-Proteins auf dem SDS PAGE-Gel im Vergleich zu den unbehandelten Tau-Proteinproben.

Protokoll

>1. Phosphatase-Assay

1. Behandeln Sie die Zelllysate, wenn die Zellen ~65 % Konfluenz erreichen (approximiert durch Mikroskopie), entfernen Sie das mit MEM ergänzte Medium und fügen Sie serumfreies MEM mit 5 μM, 10 μM und 30 μM Curcumin oder 25 mM, 50 mM und 100 mM LiCl hinzu. 24 h nach der Behandlung 24 h bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 % CO₂ inkubieren, die Zellen mit 1 ml eiskalter, phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) waschen und die Zellen mit einem Zellschaber abkratzen. Die geschabten Zellen werden in 1,5 mL Zentrifugenröhrchen überführt und 4 min bei 1.800 x g bei 4 °C zentrifugiert, um Zellpellets zu erhalten. Lysieren Sie die Zellen, indem Sie die Pellets 20 Minuten lang in 100 μl vollständigem RIPA-Puffer bei 4 °C suspendieren, während Sie regelmäßig auf die Röhrchen klopfen. Beschallen Sie die Proben kurz. Die Zellhomogenate werden in einer Tischzentrifuge bei 22.570 x g für 20 min bei 4 °C zentrifugiert. Die Überstände werden mit einer Pipette in andere markierte Röhrchen mit alkalischer Phosphatase im alkalischen Phosphatase-Puffer überführt.
   1. Bereiten Sie sowohl für Kontrollproben als auch für behandelte Proben 20 μl Proben mit 20 μg Gesamtprotein vor. Addieren Sie das Volumen der Zelllysate, das 20 μg Gesamtprotein enthält, gefolgt von 2 μl alkalischem Phosphatasepuffer und 10 μl alkalischer Phosphatase. Fügen Sie destilliertes Wasser hinzu, um 20 μl zu erhalten.
2. Die Proben werden 1 h lang bei 37 °C inkubiert. Die Reaktion wird durch Zugabe von Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) in einer Endkonzentration von 50 mM oder durch Zugabe von Natriumorthovanadat (Na₃VO₄) in einer Endkonzentration von 10 mM gestoppt. Die Reaktion kann auch durch Erhitzen auf 75 °C für 5 min gestoppt werden.
3. Bevor die Inkubation von Proben mit Phosphatase abgeschlossen ist, sind Proben der gleichen Konzentration ohne Zugabe von Phosphatase für den Vergleich mit mit Phosphatase behandelten Proben vorzubereiten.
4. Fügen Sie den frisch zubereiteten 4X SDS-Gelladepuffer mit 400 mM DTT hinzu.
5. Inkubieren Sie die Proben auf einem Heizblock bei 100 °C für 5 min. Mischen Sie die Proben mit einem Wirbel. Bei Raumtemperatur ~10-15 min abkühlen lassen.
6. Stellen Sie ein Elektrophoresesystem zusammen, um ein 10%iges Polyacrylamid-Gel mit SDS-PAGE zu betreiben.
   1. Laden Sie 10 μg Protein (13 μl Probe) pro Well auf ein 10 % Polyacrylamid-Gel. Laden Sie die Molekulargewichtsleiter.
   2. Schließen Sie nach dem Laden der Probe die positiven und negativen Elektroden des Elektrophoresesystems an eine Stromquelle an, um eine konstante Spannung aufrechtzuerhalten. Beginnen Sie zunächst 20 Minuten lang bei 70 V, um die Proteinproben aus dem Stapelgel in das Auflösungsgel zu bewegen. Erhöhen Sie dann die Spannung auf 125 V und lassen Sie das Gel ca. 70-120 Minuten lang laufen, bis die Proben und die Proteinleiter das Ende des Gels erreichen.
   3. Nach Abschluss der Elektrophorese wird das Gel mit einem Nass-Elektroblotting-System auf eine PVDF-Membran übertragen. Transfer für ~100 min bei 100 V.
   4. Markieren Sie den Blot, indem Sie einen kleinen Schnitt an der Seite der Molekulargewichtsleiter machen. Verwende eine durchsichtige Plastikfolie und einen scharfen Cutter, um den Klecks zu schneiden.
7. Blockieren Sie die Membran in einem 4%igen BSA-Blockierungspuffer für 90 min bei Raumtemperatur.
8. Inkubieren Sie den Blot über Nacht in einer Primärantikörperlösung (Anti-Tau bei 1:5.000) bei 4 °C. Waschen Sie den Tupfer viermal zu je 7 Minuten in PBST.
9. Bereiten Sie die entsprechende Sekundärantikörperlösung vor (Ziegen-Anti-Maus-IgG bei 1:5.000) und inkubieren Sie den Blot 90 Minuten lang bei Raumtemperatur. Viermal à 7 min in PBST waschen.
10. Entwickeln Sie den Blot mit einem Chemilumineszenz-Kit gemäß den Empfehlungen des Herstellers. Decken Sie den Klecks mit transparenter Plastikfolie ab. Erfassen Sie Bilder mit einem Chemilumineszenz-Bildgebungssystem für die Chemilumineszenz mit der entsprechenden Software.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
HCT 116-Zelle	ATCC	CCL-247
100 mm Schüssel	Corning	430161
MEM (EBSS)	Hyklon	SH30024.01
Fötales Rinderserum (FBS)	ThermoFisher (Gibco)	16000044	Bei -20 °C lagern
Anti-Tau 13 Antikörper	Abcam (Englisch	AB19030
Dithiothreitol (DVB-T)	Roche	Tel.: 10 708 984 001	Lagertemperatur 2–8 °C
Curcumin	Sigma-Aldrich (Fluka)	Artikel-Nr.: 78246	Lagertemperatur 2–8 °C
Anti-Tau (phospho S396) Antikörper	ABCAM	AB109390
FastAP Thermosensitive alkalische Phosphatase	Thermo Scientific	EF0651	Bei -20 °C lagern
PMSF (Englisch)	Sigma	Nr. P7626	Bei Raumtemperatur lagern
Phosphatase-Inhibitor-Cocktail	Zelluläre Signalübertragung	5870	Bei 4 °C lagern
Protease-Inhibitor-Cocktail	Zelluläre Signalübertragung	5871	Bei 4 °C lagern
Ziegen-Anti-Maus-IgG-Sekundärantikörper	ThermoFisher	Nr. A-11005	Bei 4 °C im Dunkeln lagern
Natriumdodecylsulfat (SDS)	Affymetrix	Artikel-Nr.: 75819
Molekularer Imager	Bio-Rad	ChemiDoc XRS+	Bei 4 °C lagern
RIPA-Puffer	Sigma	Nr. R 0278	Lagertemperatur 2–8 °C
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X - 100	Bei ca. 25 °C lagern
PVDF-Membran	Bio-Rad	Tel.: 162-0177
Ziegen-Anti-Maus-IgG-Sekundärantikörper	ThermoFisher	Nr. A-11005	Bei 4 °C im Dunkeln lagern
Natriumdodecylsulfat (SDS)	Affymetrix	Artikel-Nr.: 75819
Farbstoffreagenz für Proteinassays	Bio-Rad	Nr. 500-0006
Schall-Dismembrator	Fisher Scientific	Modell 500
Mikroliter-Zentrifugen	Hettich Zentrifugen	MIKRO 200 R