Single-Molecule Imaging of Nuclear Transport

Zusammenfassung

Einzel-Molekül-Mikroskopie approch neue Einblicke in atomare Transport.

Zusammenfassung

Der Nutzen des einzelnen Moleküls Fluoreszenzmikroskopie Ansätze ist nachgewiesen worden, von einem großen Anspruch in das Verständnis von biologischen Reaktionen während des letzten Jahrzehnts werden. Die Untersuchung molekularer Wechselwirkungen mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung tief in den Zellen blieb Herausforderung aufgrund der inhärent schwachen Signalen, die aus einzelnen Molekülen. Neuere Arbeiten von Yang et al. gezeigt, dass Schmalband-Bereich Epifluoreszenzmikroskopie Visualisierung von nukleozytoplasmatischen Transport ermöglicht auf der Ebene einzelner Moleküle. Durch die einzigen Molekül Ansatz, wichtige Kinetik, wie Kerntransport Zeit und Effizienz, für die Signalverarbeitung und-unabhängige Cargomoleküle gewonnen wurden. Hier haben wir beschrieben, ein Protokoll für den methodischen Ansatz mit einer verbesserten zeitlichen Auflösung von 0,4 ms und 12 nm aufweisen. Die verbesserte Auflösung ermöglichte es uns, vorübergehend den aktiven Transport und passive Diffusion Ereignisse durch die Kernporenkomplexe (NPC) erfassen in semi-intakten Zellen. Wir erwarten, dass diese Methode, um bei der Aufklärung anderer bindender und Menschenhandel Ereignisse innerhalb von Zellen verwendet werden.

Protokoll

1. Vorbereitung der Zellen für einzelnes Molekül Experiment

1. Mindestens eine Woche im Voraus, starten Sie eine neue Kultur der HeLa-Zelllinie aus einem Bestand von Auftauen bei 37 ° C und legte ihn in eine 25 cm ² Kulturflasche mit 5 ml Medium, Inkubieren Sie die Zellen bei 37 ° C innerhalb von 5% CO ₂ Inkubator für 24 Stunden und spaltete es mindestens 3-mal, um eine optimale Voraussetzung für die Zellen. Doch die Zellen nicht mehr als 20 Mal wegen Neigung ihrer Wachstumsrate erheblich langsamer gespalten werden. HeLa-Zellen wurden zuvor gentechnisch so verändert GFP (grün fluoreszierendes Protein) fusioniert mit dem Kernhülle Pore Me....

Diskussion

Es muss darauf geachtet, um eine ordnungsgemäße Kolokalisation von NE und einzelne Moleküle während des Experiments zu versichern. Es ist auch wichtig, um ein hohes Signal-Rausch-Verhältnis bieten, vor allem, wenn das Signal schwach ist aufgrund der schlechten Kennzeichnung oder Ausbleichen. Localization Präzision wird durch Hintergrundgeräusche (aus out-of-focus-Fluoreszenz, CCD Ausleserauschen, Dunkelstrom und anderen Faktoren) begrenzt.

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