Bakterielle Lieferung von RNAi Effektoren: Transkingdom RNAi

Zusammenfassung

Für die Entwicklung der RNA-Interferenz (RNAi)-basierte Therapien, wurde eine neue Strategie entwickelt, transkingdom RNAi (tkRNAi). Diese Technologie nutzt nicht-pathogenen Bakterien zu produzieren und zu liefern therapeutische kurze Haarnadel-RNA (shRNA) in Zielzellen. Hier wurde tkRNAi erfolgreich Umkehrung der klassischen ABCB1-vermittelte Multidrug-Resistenz (MDR) von Krebszellen eingesetzt.

Zusammenfassung

RNA-Interferenz (RNAi) ist ein hoch wirksamer Mechanismus für die spezifische Hemmung der mRNA-Expression. Neben ihr Potenzial als ein leistungsfähiges Labor-Tool, erscheint der RNAi für therapeutische Nutzung vielversprechend. Für die Entwicklung der RNA-Interferenz (RNAi)-basierte Therapien, die Lieferung von RNAi-vermittelnde Agenten an Zielzellen ist eine der größten Hindernisse. Eine neuartige Strategie, diese Hürde zu überwinden, ist transkingdom RNAi (tk RNAi). Diese Technologie nutzt nicht-pathogene Bakterien, z. B. Escherichia coli, zu produzieren und zu liefern therapeutische kurze Haarnadel-RNA (shRNA) in Zielzellen zu RNAi zu induzieren. Eine der ersten Generation tk RNAi-vermittelnde Vektor, TRIP, enthält die Bakteriophagen T7 Promotor für die Expression Regulation eines therapeutischen shRNA von Interesse. Darüber hinaus hat die TRIP Inv locus von Yersinia pseudotuberculosis, dass Invasin kodiert, die natürliche invasive Bakterien erlaubt, β1-Integrin-positiven Säugetierzellen und die HlyA Gen aus Listeria monocytogenes, die Listeriolysin O. Dieses Enzym produziert eingeben kann die therapeutische shRNA zu entkommen Eintrag Vesikel im Zytoplasma der Zielzelle. TRIP-Konstrukte sind zu einem kompetenten nicht-pathogene Escherichia coli-Stamm, der T7-RNA-Polymerase, die für die T7-Promotor-gesteuerte Synthese von shRNAs kodiert eingeführt. Ein gut charakterisierter Krebs-assoziierte Zielmolekül für unterschiedliche RNAi-Strategien ist ABCB1 (MDR1/P-glycoprotein, MDR1/P-gp). Das ABC-Transporter fungiert als eine Droge Extrusionspumpe und vermittelt die "klassische" ABCB1-vermittelte Multidrug-Resistenz (MDR) Phänotyp von menschlichen Krebszellen, die durch eine spezifische Kreuzresistenz Muster geprägt ist. Verschiedene ABCB1-exprimierende MDR Krebszellen wurden mit anti-ABCB1 shRNA Expressionsvektor trägt E. behandelt coli. Dieses Verfahren führte zu einer Aktivierung der RNAi Wege innerhalb der Krebszellen und eine beträchtliche Down-Regulation der ABCB1 codierenden mRNA sowie den entsprechenden Medikamenten Extrusionspumpe. Dementsprechend wurde Kumulation in der unberührten resistente Krebszellen verbessert und die MDR Phänotyp wurde rückgängig gemacht. Durch dieses Modell die Daten liefern die Proof-of-concept, dass tk RNAi geeignet für die Modulation von Krebs-assoziierte Faktoren, z. B. ABCB1, in menschlichen Krebszellen ist.

Protokoll

1) Bakterielle Lieferung von shRNAs

1. Bevor Sie mit der Bakterienkultur, muss man LB-Medium und LB-Agar vorzubereiten.
2. Für die LB-Medium abwiegen Hefeextrakt (0,5% w / v), Bacto Trypton (1,0% w / v) und NaCl (0,6% w / v) gelöst und diese Komponenten in aqua bidest. Die vorbereiteten Lösungen müssen in einem Autoklaven sterilisiert werden und sind dann einsatzbereit.
3. Für LB-Agarplatten Bacto-Agar (1,5% w / v) muss an die LB-Medium früheren zur Sterilisation hinzugefügt werden.
4. Aufheizen LB-Agar in der Mikrowelle bis zur LB-Agar vollständig gelöst ist. Lassen Sie die Lösung abkühlen, bis die Flasche leicht und ohne sich zu verbren....

Diskussion

Die Zellzahl für eine Infektion ausgesät und die entsprechenden MOI verwendet, sich kritisch mit den Zelllinien unter Beobachtung und deren Geschwindigkeit des Wachstums ab. Um eine optimale Zellzahl für die Aussaat sind pre-Experimente, um die Geschwindigkeit des Wachstums bestimmen dringend empfohlen. Daneben sollten verschiedene MOIs aufgrund der begrenzten getestet werden zu verlängern, um die Zellen können die bakterielle Invasion, ohne zu sterben von Stress stehen. Der optimale Zeitpunkt, wo die Down-Regulation de.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Agar	Biochrom AG	214050
Amphotericin B	Biochrom AG	A2612
Dulbeccos phosphatgepufferte Salzlösung – PBS (10×)	Invitrogen GmbH	14080048
E. coli ceq221	Cequent Pharmaceuticals Inc.		Kein Katalog verfügbar, direkte Bestellung
Gentamycin	Biochrom AG	A2710
Penicillin/Streptomycin	Invitrogen GmbH		Enthält 5.000 Einheiten Penicillin (Base) und 5.000 μg Streptomycin (Base)/ml, hergestellt aus Penicillin G (Natriumsalz) und Streptomycinsulfat in 0,85 %iger Kochsalzlösung.
Natriumchlorid	Merck KgaA	1064060500
Tryptone	Difco Laboratories	211705
Hefeextrakt	Difco Laboratories	212750