In utero Elektroporation ist eine wertvolle Methode zur Transfektion von neuronalen Vorläuferzellen in vivo. Abhängig von der Platzierung der Elektroden und der Entwicklungspsychologie Zeitpunkt der Elektroporation können bestimmte Teilmengen von kortikalen Zellen ausgerichtet werden. Gezielte Zellen können dann in vivo oder in vitro für die Auswirkungen der genetischen Veränderung untersucht werden.
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Methodenartikel
In utero Elektroporation gefolgt von primären neuronalen Kultur für ein Studium Gene Function in Subset von kortikalen Neuronen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
In-vitro-Studie der primären neuronalen Kulturen ermöglicht quantitative Analysen von Neuriten. Um zu untersuchen, wie genetische Veränderungen neuronaler Prozess Auswuchs, shRNA-oder cDNA-Konstrukte können in primären Neuronen über chemische Transfektion oder virale Transduktion eingeführt werden beeinträchtigt. Doch mit primären kortikalen Zellen sind eine heterogene Pool von Zelltypen (glutamatergen Neuronen aus verschiedenen Schichten, hemmenden Neuronen, Gliazellen) transfiziert mit diesen Methoden. Die Verwendung von in utero Elektroporation DNA-Konstrukte in der embryonalen Nagetier Kortex vorstellen können für bestimmte Untergruppen von Zellen gezielt zu: Während die Elektroporation von frühen embryonalen Kortex Ziele tiefen Schichten der Hirnrinde, Ziele Elektroporation am späten embryonalen Zeitpunkten mehr oberflächlichen Schichten. Darüber hinaus Differential Platzierung der Elektroden über die Köpfe der einzelnen Embryonen Ergebnisse in der Ausrichtung der dorsal-medial gegen ventral-lateralen Regionen des Kortex. Nach der Elektroporation können transfizierte Zellen aus zerlegt werden, dissoziiert und vernickelt in vitro für die quantitative Analyse von Neuriten. Hier bieten wir Ihnen eine Schritt-für-Schritt-Methode zur quantitativen Messung neuronaler Prozess Auswuchs in Teilmengen von kortikalen Zellen.
Das grundlegende Protokoll für die in utero Elektroporation wurde im Detail in zwei anderen JoVE Artikel aus dem Kriegstein Labor 1, 2 beschrieben. Wir geben einen Überblick über unser Protokoll für in utero Elektroporation, die sich auf die wichtigsten Details, durch eine Beschreibung unseres Protokoll, das in utero Elektroporation gilt für die Untersuchung von Genfunktionen in neuronalen Prozess Auswuchs gefolgt.
Protokoll
Das grundlegende Protokoll für die in utero Elektroporation wurde im Detail in einem anderen JoVE Artikel aus der Kriegstein Labor 1, 2 beschrieben. Diese Technik wurde ursprünglich in den Osumi lab 3 beschrieben und unser Protokoll basiert auf einer im LoTurco Lab 4 entwickelt wurde. Wir geben einen Überblick über die unser Protokoll für in utero Elektroporation von Ratte Embryonen, die sich auf die wichtigsten Details, durch eine Beschreibung unseres Protokoll, das in utero Elektroporation gilt für die Untersuchung von Genfunktionen in neuronalen Prozess Auswuchs gefolgt.
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Diskussion
In-vitro-Studie der primären neuronalen Kulturen ermöglichen quantitative Analysen von Neuriten. Um zu untersuchen, wie genetische Veränderungen neuronaler Prozess Auswuchs beeinflussen können shRNA oder misexpression Konstrukte in primären Neuronen über chemische Transfektion oder virale Transduktion eingeführt werden. Doch mit primären kortikalen Zellen sind eine heterogene Pool von Zelltypen (glutamatergen Neuronen aus verschiedenen Schichten, hemmenden Neuronen, Gliazellen) transfiziert mit diesen Methoden........
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Offenlegungen
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Danksagungen
Die Autoren bedanken sich bei Joseph LoTurco und Dennis Selkoe für hilfreiche Diskussionen über diese Technik zu danken. Die Autoren danken den Spendern der American Health Assistance Foundation, für die Unterstützung dieser Forschung.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 10X Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) (ohne Ca+2 /Mg +2) | GIBCO, by Life Technologies | 14185-052 | |
| 10X Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) (mit Ca+2 /Mg +2) | GIBCO, by Life Technologies | 14065-056 | |
| 1 M HEPES, pH 7,4 | GIBCO, by Life Technologies | 15630-080 | |
| Petrischalen, 100 × 15 mm | Fisher Scientific | 08-757-12 | |
| Petrischalen, 60 × 15 mm | BD Biosciences | 351007 | |
| Kegelförmiges Röhrchen, 15 mL | Sarstedt Ltd | 62-547-205 | |
| Kegelförmiges Röhrchen, 50 mL | Sarstedt Ltd | 62-554-205 | |
| Schere | Fine Science Tools | 91402-12 | |
| Standard-Pinzette | Fine Science Tools | 11000-12 | |
| Gebogene Pinzette | Fine Science Tools | 11273-20 | |
| Feinpinzette | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Vannas-Spring-Scheren | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Trypsin-EDTA, 0,25 % | GIBCO, by Life Technologies | 25200 | |
| Reichert Bright-Line-Blutkörperchenzähler | Hausser Scientific | 1490 | |
| Handzähler | Sigma-Aldrich | Z169021 | |
| Dulbecco’s modifiziertes Eagle-Medium (D-MEM) | GIBCO, by Life Technologies | 11960-051 | |
| Fetales Rinderserum | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| Penicillin-Streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140 | |
| L-Glutamin | GIBCO, by Life Technologies | 25030 | |
| NEUROBASAL-Medium | GIBCO, by Life Technologies | 21103-049 | |
| B-27-Zusatzmittel, serumfrei | GIBCO, by Life Technologies | 17504-044 | |
| GlutaMAX-I-Zusatzmittel | GIBCO, by Life Technologies | 35050-061 | |
| Gentamicin-Reagenzlösung | GIBCO, by Life Technologies | 15750-060 | |
| Paraformaldehyd | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Phosphatgepufferte Kochsalzlösung | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Eselsserum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Antikörper gegen beta-III-Tubulin | Chemicon International | MAB1637 | |
| MAP2-Antikörper | Chemicon International | AB15452 | |
| Donkey-Cy3-anti-Maus | Jackson ImmunoResearch | 715-166-151 | |
| Donkey-Cy2-anti-Huhn | Jackson ImmunoResearch | 703-226-155 | |
| DAPI | GIBCO, by Life Technologies | D3571 | |
| CC2-beschichtete Zweikammerobjektträger | Lab-Tek | 154852 | |
| Fluoreszenz-Einbettmedium | KPL Inc | 71-00-16 | |
| Mikro-Deckgläser, 24 × 60 mm | VWR international | 48393-106 | |
| Klarer Nagellack | Electron Microscopy Sciences | 72180 | |
| Ketamin | Henry Schein | 995-2949 | |
| Xylazin | Henry Schein | 4015809TV | |
| Buprenorphin | Henry Schein | 1118217 | |
| Picospritzer III | Parker Hannifin Corporation | ||
| BTX-Quadratwellen-Elektroporator | Fisher Scientific | BTXECM830 | |
| Tweezertroden, 7 mm, Platin | Harvard Apparatus | 450488 |
Referenzen
- Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. J Vis Exp. , (2007).
- Walantus, W., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E16 rat embryos. J Vis Exp
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Nachdrucke und Genehmigungen
