Methodenartikel

Herstellung von biologisch abgeleiteten Injizierbare Materialien für Myocardial Tissue Engineering

DOI:

10.3791/2109

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20. Dezember 2010

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1University of California, San Diego

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Verfahren zur Herstellung eines injizierbaren Matrix-Gel aus dezellularisierte Gewebe und Injektion in Ratten-Myokard In vivo Beschrieben sind.

Zusammenfassung

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Dieses Protokoll bietet Methoden für die Herstellung eines injizierbaren extrazellulären Matrix (ECM)-Gel für myokardiale Tissue Engineering-Anwendungen. Kurz gesagt, ist dezellularisierte Gewebe lyophilisiert, gefräst, enzymatisch verdaut und anschließend auf physiologischen pH-Wert gebracht. Die Gefriertrocknung entfernt alle Wassergehalt aus dem Gewebe, was zu trockenen ECM, die in ein feines Pulver mit einer kleinen Mühle gemahlen werden. Nach dem Mahlen wird die ECM-Pulver mit Pepsin verdaut, um eine injizierbare Form einer Matrix. Nach Einstellung auf pH 7,4, kann die Flüssigkeit Matrix-Material in den Herzmuskel injiziert werden. Die Ergebnisse der bisherigen Charakterisierung Tests haben gezeigt, dass Matrix Gele aus dezellularisierte Perikarderguss und Herzmuskelgewebe produziert nativen ECM-Komponenten, darunter verschiedene Proteine, Peptide und Glykosaminoglykanen behalten. Bei der Verwendung dieses Materials für das Tissue Engineering, in vivo Charakterisierung ist besonders nützlich, hier ein Verfahren zur Durchführung eines intramuralen Injektion in den linken Ventrikel (LV) frei an der Wand wird als Mittel zur Analyse der Host-Reaktion auf die Matrix-Gel in vorgestellt ein kleines Tier-Modell. Der Zugang zu den Brustraum wird durch die Membran gewonnen und die Injektion ist leicht über die Spitze in der LV freien Wand gemacht. Die biologisch abgeleiteten Gerüst visualisiert werden durch Biotin-Markierung vor der Injektion und dann Färbung Gewebeschnitte mit einem Meerrettichperoxidase-konjugierten Neutravidin und Visualisieren über Diaminobenzidin (DAB) Färbung. Die Analyse der Injektion Region kann auch mit histologischen und immunhistochemischen Färbung durchgeführt werden. Auf diese Weise wurden die bisher untersuchten Herzbeutel und Herzmuskel-Matrix-Gelen gezeigt, faserige, poröse Netzwerke zu bilden und zu fördern Gefäßbildung innerhalb der Injektion Region.

Protokoll

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1. Pre-processing Tissue Vorbereitung

  1. Bevor Sie dieses Protokoll, muss man schon dezellularisierte das Gewebe der Wahl. Für dieses Beispiel sind frisch vom Schwein und Mensch Herzbeutel Proben dezellularisierte mit hypotonischen und hypertonischen spült in deionisiertem Wasser (DI) und Natriumdodecylsulfat (SDS).
  2. Insbesondere ersten Waschen der Schweine Herzbeutel in DI-Wasser für 30 Minuten, dann kontinuierlich rühren in 1% SDS in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) für 24 Stunden, gefolgt von einer 5-stündigen DI Wasser abspülen. Für Menschen pericardia, zuerst in DI Wasser spülen für 30 Minuten, dann rühren kontinuierlich ....

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Diskussion

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Diese Methode ermöglicht die Generierung von biologisch abgeleitet, injizierbare Gerüste für myokardiale Tissue Engineering. Obwohl diese Methoden wurden ursprünglich für die Herstellung entwickelt und in vivo Tests eines Myokard-Matrix-Gel und hier mit einem Perikarderguss Matrix-Gel vorgestellt, dieses Protokoll für die Verwendung mit einem beliebigen Gewebe angepasst werden, sofern das Gewebe angemessen sein dezellularisierte. Dezellularisierung sollte durchgeführt werden und vor der Anwendung dieser Methode.......

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Offenlegungen

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Nutzung von Tieren: Alle Versuche in dieser Studie wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Institutional Animal Care und Verwenden Ausschuss an der University of California, San Diego und der American Association for Accreditation of Laboratory Animal Care veröffentlicht durchgeführt.

Danksagungen

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Diese Arbeit wurde teilweise durch New Innovator des NIH Director Award Program, Teil der NIH Roadmap for Medical Research, über Grant-Nummer 1-DP2-OD004309-01 unterstützt. SBS-N. möchte die NSF für ein Graduate Research Fellowship bedanken.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Reagenzien:
PepsinSigma-Aldrichp6887-1GLyophilisiert
BiotinThermo Fisher Scientific, Inc.21217
Neutravidin-HRPThomas Scientific21130
Ausstattung:
Wiley Mini MillThomas Scientific3383L10
Labconco-LyophilisatorLabconco Corp.7670520
Chirurgisches Zubehör:
BetadinePurdue Products L.P.67618-154-16
Lösung mit Ringer-LaktatMWI Veterinary Supply003966
KY JellyMWI Veterinary Supply28658
Lidocain, 2 %MWI Veterinary Supply17767
BuprenorphinhydrochloridReckitt Benckiser12496-0757-1
Künstliche Tränen-SalbeFisher ScientificNC9860843
Dreifach-Antibiotika-SalbeFisher Scientific19082795
IsofluranMWI Veterinary Supply60307-120-25
Otoskop MWI Veterinary Supply008699
StopfkranMWI Veterinary Supply006245
Vicryl-Naht 3-0MWI Veterinary SupplyJ327H
Proline-Naht 5-0MWI Veterinary Supplys-1173
Reverse-Cutting-(RC)-NadelEthicon Inc.8684G
Microhämostaten Feine Wissenschaftliche Werkzeuge13013-14
Rattenzahn-MikrozangeFeine Wissenschaftliche Werkzeuge11084-07
Skalpell Nr. 10Feine Wissenschaftliche Werkzeuge10110-01
Stumpfe SchereFeine Wissenschaftliche Werkzeuge14108-09
Scharfe, gekrümmte SchereFeine Wissenschaftliche Werkzeuge14085-08
Große, gezahnte PinzetteFeine Wissenschaftliche Werkzeuge1106-12
PE160 AbsaugrohrBD Biosciences427430
Haarschneider MWI Veterinary Supply21608
Hautheftklammern/-klammergerät Ethicon Inc.PRR35
Allgemeines Zubehör:
Rührplatten
0,1 M HCl
1 M NaOH
10x PBS
1x PBS
70 % Ethanol
0,1-mL-Spritzen
10-mL-Spritze
Q-Tips
Chirurgischer Kleber
Chirurgisches Tuch
Handtuchklemmen
Kleine handgehaltene Vakuumpumpe

Referenzen

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  1. Seif-Naraghi, S. B., Salvatore, M. A., Magoffin-Schup, P. J., Hu, D. P., Christman, K. L. Design and characterization of an injectable pericardial matrix gel: A potentially autologous scaffold for cardiac tissue engineering. Tissue Engineering. , (2009).
  2. Freytes, D. O., Martin, J., Velankar, S. S., Lee, A. S., Badylak, S. F.

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Schlagwörter

Extrazellul re MatrixGewebedezellularisierungECM PulverPepsinverdauinjizierbares Gelintramurale Injektionhistologische Analyseimmunhistochemische F rbungBiotin Markierungvaskul re Infiltration

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