Hier präsentieren wir die intrakranielle Injektion von AAV-Vektoren für die Fluoreszenzmarkierung von Neuronen und Gliazellen in der Sehrinde.
Abstract
Intrakranielle Injektion von viralen Vektoren entwickelt, um ein fluoreszierendes Protein exprimieren ist eine vielseitige Kennzeichnung Technik zur Visualisierung von bestimmten Untergruppen von Zellen in verschiedenen Hirnregionen in vivo und in Hirnschnitten. Anders als die Injektion von Fluoreszenzfarbstoffen, bietet virale Kennzeichnung der gezielten Förderung einzelner Zelltypen und ist weniger teuer und zeitaufwendig ist als Einführung transgener Mauslinien. Bei dieser Technik wird ein Adeno-assoziierte Viren (AAV) Vektor injiziert intrakraniell mit stereotaktischen Koordinaten einer Mikropipette und eine automatische Pumpe für präzise Lieferung von AAV auf den gewünschten Bereich mit minimaler Schädigung des umliegenden Gewebes. Injection-Parameter können auf einzelne Experimente durch Anpassung der Tier-Alter an der Injektionsstelle, Injektion Lage, Injektionsvolumen, die Rate der Injektion, AAV-Serotyp und der Promotor, der die Genexpression zugeschnitten werden. Je nach den gewählten Bedingungen kann viral-induzierter Transgenexpression erlauben die Visualisierung von Gruppen von Zellen, einzelne Zellen oder feinen zelluläre Prozesse, bis auf die Ebene von dendritischen Dornen. Die hier gezeigten Experiment zeigt eine Injektion von doppelsträngiger AAV, die grün fluoreszierendes Protein für die Kennzeichnung von Neuronen und Gliazellen in der Maus primären visuellen Kortex.
Protocol
1. Virus Handhabung und Lagerung Richtiger Schutz und Umgang mit Techniken sollten auf der Grundlage der biologischen Sicherheit des Virus verwendet werden gewählt werden. Diese Praktiken können in Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 5. Auflage, auf der CDC-Website gefunden werden ( http://www.cdc.gov/od/OHS/biosfty/bmbl5/bmbl5toc.htm ). Die Verwendung von AAV-Vektoren für Biosafety Level 1 (BSL-1) gen…
Discussion
Viral-vermittelte Gentransfer birgt ein großes Potenzial für die Untersuchung der neurologischen Prozesse und Behandlung von Störungen des Gehirns 1,2,3. Die große Vielseitigkeit dieser Technik kann auch genutzt werden, um Fluoreszenz-Label-Zellen für die Bildgebung sowohl in vitro und in vivo4 sein. Hier zeigen wir ein detailliertes Verfahren für die Transduktion von Neuronen und Gliazellen in Maus visuellen Kortex mit einer doppelsträngigen Adeno-Verein Virus, das Enhanc…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde ermöglicht durch Zuschüsse aus dem NIH (EY012977), ein Career Award in der Biomedizin von der Burroughs Wellcome Fund, der Whitehall-Stiftung, und die Sloan Foundation (AKM).
Materials
Material Name
Typ
Company
Catalogue Number
Comment
Stoelting Mouse and Neonatal Rat Adaptor
Stoelting
51625
Regular stereotax for securing animals for surgery may be substituted
Extra Fine Bonn Scissors, 8.5cm, straight tip, cutting edge 13mm
Fine Science Tools
14084-08
Eye Dressing Forceps, 10cm, tip width 0.5mm, curved
Fine Science Tools
11152-10
Dumont #5/45 Forceps- Dumoxel Standard Tip, 11cm, angled
Fine Science Tools
11251-35
Extra-fine tipped forceps for performing craniotomy
Standard Pattern Forceps, straight, 2.5mmx1.35mmtip, 12cm
Fine Science Tools
11000-12
Microtorque Control Box and Tech2000 handpiece
Ram Products, Inc.
TECH2000ON/OFF
Dental drill
Micro Drill Stainless Steel Burrs 1.4mm tip diameter
Fine Science Tools
19008-14
Wiretrol micropipettes, to deliver 1-5 Ul
VWR International/ Drummond
5-000-1001 or 53480-287
Mineral oil
VWR International
29447-338
Manual Micromanipulator and Tilting Base (right-handed)
World Precision Instruments, Inc.
M3301-M3-R
Used for determining stereotaxic co-ordinates
UltraMicroPump (UMP3) (one) with SYS-Micro4 Controller
World Precision Instruments, Inc.
UMP3-1
Sutures
VWR International
95056-952
P-97 Flaming/Brown Micropipette Puller
Sutter Instruments
P-97
Tobradex
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