Summary
Se describe el procedimiento para preparar etapas
Abstract
El embrión de Drosophila es un sistema modelo atractivo para la investigación de las bases celulares y moleculares del desarrollo neuronal. A continuación se describe el procedimiento para la visualización de Drosophila sistema nervioso embrionario utilizando anticuerpos contra las proteínas neuronales. Ya que toda la embrionaria sistemas nervioso periférico nervioso central y están bien caracterizados a nivel de células individuales (Dambly-Chaudière et al, 1986;.. Bodmer et al, 1987;. Bodmer et al, 1989), cualquier aberración que estos sistemas pueden identificar fácilmente el uso de anticuerpos a diferentes proteínas neuronales. Los embriones en desarrollo se reúnen en ciertos momentos para asegurarse de que los embriones se encuentran en las etapas de desarrollo adecuado para la visualización. Después de la recolección, las capas externas del embrión, el corion y la membrana de la envoltura vitelina que rodea el embrión, se retiran antes de la fijación. Los embriones se incuban con anticuerpos neuronales y se visualizan con fluorescencia utilizando anticuerpos secundarios marcados. Los embriones en etapas 12-17 se visualizan para acceder al sistema nervioso embrionario. En la 12 ª etapa de la banda germen del SNC se inicia el acortamiento y la etapa 15 el patrón definitivo de la comisura se ha logrado. Por la etapa 17 de los contratos del SNC y SNP está completamente desarrollado (Campos-Ortega et al. 1985). Así, los cambios en el patrón del SNP y SNC pueden ser fácilmente observados durante estas etapas de desarrollo.
Protocol
1. Preparación de los reactivos
- Prepare el tampón PEMFA utilizando canalizaciones con 100 mM, EGTA 2 mM y 1 mM MgSO 4. Ajustar el pH de la solución a 7,0. El buffer PEMFA es esterilizado por filtración y se almacenan a 4 ° C.
- Prepare PBT mediante la adición de 1 ml de Triton X-100 a 100 ml 1x PBS (tampón fosfato salino) (pH 7,0). Almacenar a 4 ° C.
- Preparar 5% de BSA (albúmina de suero bovino) con un 0,01% NaAcide en 1X PBS (pH 7,0).
- Prepare la solución salina con 0,7% NaCl y 0,03% Triton X-100 en agua destilada.
- Preparar el fijador mediante la combinación de 4 partes de búfer PEMFA con formaldehído parte un 37%.
2. Recolección de embriones
- Prepare una caja para la cepa de Drosophila de interés mediante la colocación de> 100 moscas en una botella de plástico que contiene un adaptador de alimentación con placa de agar.
- Salir de la jaula de las moscas en la oscuridad a temperatura ambiente durante 72 horas, cambio de placas cada 8-12 horas, de modo que las moscas se acostumbren a la jaula y no tienen sus huevos.
- Para el experimento se recogen los embriones durante 12 horas. Retire la placa de Petri del contenedor y reemplazarlo. Tome la placa de Petri quitar y lavar los embriones de la cápsula, utilizando la solución salina y una brocha limpia.
- Recoger los embriones en un colador fino. Enjuagar con solución salina para eliminar cualquier exceso de levadura.
- Usando una espátula suavemente recoger los embriones y colocarlos en un frasco de vidrio con una tapa. Añadir alrededor de 1 ml de solución salina.
3. La eliminación de las membranas Chorion y vitelina y fijación
- Después de la recolección de embriones, preparar la solución de heptano-Fix mediante la combinación de 50% de heptano y 50% de fijador. La solución será en capas con heptano en la parte superior y el fijador en la parte inferior.
- En el frasco de vidrio lavado de los embriones, mediante su incubación en la solución salina durante 5 minutos. Retire el exceso de solución salina con una pipeta Pasteur.
- Enjuague los embriones con agua destilada.
- Dechorionate los embriones, mediante su incubación en el 50% de lejía durante 3 minutos.
- Enjuague los embriones a fondo con agua destilada.
- Fijar los embriones, mediante su incubación durante 30 minutos en la solución de heptano-Fix con agitación suave.
- Con una pipeta Pasteur reemplazar el fijador (capa inferior) con metanol dejando el heptano en el tubo. Agitar enérgicamente para eliminar la membrana vitelina. Los embriones devitellinized se hunden hasta el fondo del tubo.
- Recoger los embriones en un frasco de vidrio nuevo con una pipeta Pasteur. Enjuague los embriones cinco veces con metanol, cada vez que los embriones se incuban durante 5 minutos.
4. La tinción de anticuerpos, de montaje y visualización
- Rehidratar a los embriones en una mezcla de 50% de la solución PBT y 50% de metanol durante 5 minutos. Luego rehidratar en un 100% la solución PBT durante 5 minutos.
- Bloquear los embriones, mediante su incubación en 5% de BSA con una solución de NaAcide 0,01% durante 1 hora a 4 ° C.
- Los embriones están listos para la tinción de anticuerpos. Prepare el anticuerpo primario mediante la dilución a la concentración adecuada con 5% de BSA con una solución de NaAcide 0,01%. Nosotros usamos un anticuerpo contra la proteína de cadena de cisteína (CSP), una proteína sináptica vesicular y un anticuerpo anti-HRP rábano o caballo peroxidasa, que reconoce neuronal específica en hidratos de carbono fracción presente en las glicoproteínas de superficie y las etiquetas de todas las neuronas.
- Incubar los embriones durante la noche a 4 ° C en la solución de anticuerpo primario.
- Al día siguiente, lave los embriones 10 veces con PBT en el transcurso de una hora.
- Prepare la solución secundaria de anticuerpos mediante la dilución de la concentración adecuada. Utilizamos anticuerpos Alexa secundaria a una concentración de 1:200.
- Incubar los embriones durante dos horas en 4 ° C en la solución de anticuerpo secundario.
- Lavado de los embriones 10 veces con PBT en el transcurso de una hora.
- Incubar los embriones durante la noche en medio Vectashield montaje.
- Monte de los embriones en un portaobjetos de vidrio y sellar la hoja de la cubierta con esmalte de uñas. Visualizar embriones utilizando un microscopio de fluorescencia.
5. Resultados representante
CSP 
HRP-FITC 
Se fusionó
Figura 1: Una imagen representativa que muestra el sistema nervioso central embrionarias en la etapa 16-17, el uso de anticuerpos contra la CSP (rojo) y HRP (verde). Tenga en cuenta la coloración distinta de la comisura.
CSP 
HRP-FITC
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Se fusionó
Figura 2: Un representante de las imágenes que muestra el PNS embrionarias en la etapa 16-17 usando anticuerpos contra la CSP (rojo) y HRP (verde). Tenga en cuenta los patrones repetidos de las neuronas periféricas.
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Discussion
El embrión de Drosophila es un potente sistema para la investigación de los cambios celulares y moleculares durante el desarrollo neuronal. En este protocolo se ha demostrado la forma de preparar todo el montaje embriones para inmunohistoquímica. Nos hemos adaptado a partir de este protocolo el protocolo descrito en Carroll y Scott, 1985. Este protocolo también se puede adaptar a otra prueba de anticuerpos neuronales, pero la optimización de los anticuerpos se debe hacer. Además, los defectos del desarrollo embrionario del SNP y el SNC se puede visualizar fácilmente mediante la comparación de los embriones de diferentes líneas de mutantes. Hemos utilizado con éxito este protocolo para visualizar el SNP y el SNC en los embriones mutantes llevar proteína motora. Bajo una gran ampliación que también han evaluado las pistas axonal en el SNP y SNC embrionario.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
SG es apoyado por fondos de la Universidad Estatal de Nueva York en Buffalo y de John R. Oishei Fundación.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 37% formaldehyde | Fisher Scientific | BP531-25 | |
| CSP | Developmental Studies Hybridoma Bank | ||
| HRP-FITC | Jackson ImmunoResearch | 323-095-021 | |
| Alexa Fluor 568 Goat Anti-Mouse IgG | Invitrogen | A-11004 | |
| Vectashield Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 |
References
- Bodmer, R., Barbel, S., Sheperd, S., Jack, J. W., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Transformation of sensory organs by mutations of the cut locus of D. melanogaster. Cell. 51, 293-307 (1987).
- Bodmer, R., Carretto, R., Jan, Y. N. Neurogenesis of the peripheral nervous system in Drosophila embryos: DNA replication patterns and cell lineages. Neuron. 3, 21-32 (1989).
- Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. The Embryonic Development of Drosophila melanogaster. , Springer-Verlag. New York. (1985).
- Carroll, S. B., Scott, M. P. Localization of the fushi tarazu protein during Drosophila embryogenesis. Cell. 43, 47-57 (1985).
- Dambly-Chaudière, C., Ghysen, A., Jan, Y. N., Jan, L. Y. Muscle connections between imaginal discs in Drosophila. Developmental Biology. 113, 288-294 (1986).
