Summary
نحن تصف الإجراء الذي قام بإعداد
Abstract
الجنين هو نظام ذبابة الفاكهة نموذجا جذابا للتحقيق في الأساس الخلوية والجزيئية للتنمية الخلايا العصبية. نحن هنا وصف التصور الداخلي للنظام العصبي الجنيني ذبابة الفاكهة باستخدام الأجسام المضادة للبروتينات الخلايا العصبية. منذ تتميز جيدا الجنينية محيطي بأكمله العصبي المركزي والجهاز العصبي على مستوى الخلايا الفردية (Dambly - Chaudière وآخرون ، 1986 ؛. بودمر وآخرون ، 1987 ؛. بودمر وآخرون ، 1989) ، أي انحرافات يمكن لهذه النظم يمكن التعرف عليها بسهولة باستخدام الأجسام المضادة للبروتينات الخلايا العصبية المختلفة. يتم جمع الأجنة النامية في أوقات معينة لضمان أن الأجنة في المراحل التنموية المناسبة لالتصور. بعد جمعها ، وإزالة الطبقات الخارجية من الجنين ، والغشاء المغلف المشيماء المحي الذي يحيط الجنين ، قبل التثبيت. ثم يتم تحضين الأجنة مع الأجسام المضادة الخلايا العصبية وتصور باستخدام الأجسام المضادة الثانوية fluorescently المسمى. أجنة في مراحل 12-17 هي تصور للوصول إلى النظام العصبي الجنيني. في المرحلة ال 12 فرقة الجرثومية يبدأ الجهاز العصبي المركزي وتقصير مرحلة 15 أحرز نمط محدد للصوار. قبل 17 مرحلة يتم تطويره بالكامل العقود في الجهاز العصبي المركزي والجهاز العصبي المحيطي (كامبوس اورتيغا وآخرون 1985). بالتالي يمكن تغيير في نمط الجهاز العصبي المحيطي والجهاز العصبي المركزي يلاحظ بسهولة خلال هذه المراحل التنموية.
Protocol
1. إعداد الكواشف
- يعد استخدام أنابيب عازلة PEMFA 100mM ، EGTA 2mm و، و 1 ملي MgSO 4. ضبط الرقم الهيدروجيني للعازلة ل7.0. غير معقمة تصفية العازلة PEMFA وتخزينها في 4 درجة مئوية.
- إعداد PBT بإضافة 1ml من تريتون X - 100 ل100ML 1X PBS (الفوسفات التخزين المؤقت مالحة) (الرقم الهيدروجيني 7.0). المحل في 4 درجات مئوية.
- إعداد جيش صرب البوسنة 5 ٪ (الأبقار مصل الزلال) مع 0.01 ٪ في NaAcide PBS 1X (الرقم الهيدروجيني 7.0).
- تحضير المحلول الملحي باستخدام كلوريد الصوديوم 0.7 ٪ و 0.03 ٪ تريتون X - 100 في الماء منزوع الأيونات.
- إعداد مثبت من خلال الجمع بين 4 أجزاء PEMFA العازلة مع فورمالديهايد جزء 1 37 ٪.
2. جمع الأجنة
- تحضير قفص لسلالة ذبابة الفاكهة ذات الاهتمام بوضع> 100 ذبابة في زجاجة بلاستيكية تحتوي على محول مع لوحة التغذية آغار.
- مغادرة قفص من الذباب في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 72 ساعة ، وتغيير لوحات كل 8-12 ساعة ، بحيث تحصل على تأقلم الذباب على القفص ولا تحمل بيضها.
- للتجربة جمع الأجنة لمدة 12 ساعة. إزالة طبق بيتري من الحاويات واستبدالها. تأخذ طبق بيتري إزالتها وغسل الأجنة خارج الطبق باستخدام محلول ملحي ، وفرشاة الدهان النظيفة.
- جمع الأجنة في منخل الغرامة. التشطيف مع المياه المالحة لإزالة أي الخميرة الزائدة.
- باستخدام ملعقة اختيار برفق حتى الأجنة ووضعها في قارورة زجاجية صغيرة مع قبعة. إضافة نحو 1ml من محلول ملحي.
3. إزالة الأغشية كوريون والمحية والتثبيت
- بعد جمع الأجنة ، يعد الحل الهيبتان فيكس من خلال الجمع بين 50 ٪ و تثبيتي هيبتان 50 ٪. وسيتم حل مع الطبقات هيبتان على رأس وتثبيتي في القاع.
- في قارورة زجاجية غسل الأجنة التي تفرخ لهم في محلول ملحي لمدة 5 دقائق. إزالة الملوحة الزائدة باستخدام ماصة باستور.
- شطف مع الماء منزوع الأيونات الأجنة.
- Dechorionate الأجنة التي تفرخ لهم في المبيض بنسبة 50 ٪ لمدة 3 دقائق.
- شطف جيدا بالماء الأجنة منزوع الأيونات.
- إصلاح الأجنة التي تفرخ لهم لمدة 30 دقيقة في حل الهيبتان فيكس مع اهتزاز لطيف.
- باستخدام ماصة باستور محل تثبيتي (الطبقة السفلي) مع ترك هيبتان الميثانول في الأنبوب. هزة بقوة لإزالة الغشاء المحي. والأجنة devitellinized تنزل الى قاع الأنبوب.
- جمع الأجنة في قارورة زجاجية جديدة باستخدام ماصة باستور. شطف الأجنة خمس مرات مع الميثانول ، واحتضان كل مرة الأجنة لمدة 5 دقائق.
4. يلطخ الأضداد ، تركيب ، والتخيل
- ترطيب الأجنة في خليط من حل PBT 50 ٪ والميثانول بنسبة 50 ٪ لمدة 5 دقائق. ثم في محلول ترطيب PBT 100 ٪ لمدة 5 دقائق.
- كتلة الأجنة التي يحتضنها منهم في جيش صرب البوسنة 5 ٪ مع الحل NaAcide 0.01 ٪ لمدة 1 ساعة بمعدل 4 درجات مئوية.
- الأجنة هي الآن جاهزة للتلوين الأجسام المضادة. إعداد الأجسام المضادة الأولية عن طريق تمييع لتركيز المناسبة باستخدام BSA 5 ٪ مع الحل NaAcide 0.01 ٪. نستخدم جسم ضد بروتين السيستين سلسلة (CSP) ، وهو بروتين الحويصلي متشابك والبيروكسيداز الفجل المضادة للحصان أو HRP الأضداد ، والذي يعترف العصبية محددة شاردة الكربوهيدرات الموجودة في المياه السطحية والتسميات جليكوبروتينات جميع الخلايا العصبية.
- احتضان الأجنة بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية في حل الأجسام المضادة الأولية.
- في اليوم التالي ، وغسل الأجنة 10 مرات مع PBT على مدى ساعة.
- إعداد الحل الضد الثانوي بحلول تمييع تركيز مناسبة. نستخدم الأضداد اليكسا الثانوية في تركيز 1:200.
- احتضان الأجنة لمدة ساعتين في 4 درجات مئوية في حل الضد الثانوية.
- غسل الأجنة 10 مرات مع PBT على مدى ساعة.
- احتضان الأجنة بين عشية وضحاها في متوسطة Vectashield التركيب.
- جبل الأجنة على شريحة زجاجية وختم زلة تغطية بطلاء الأظافر. تصور أجنة باستخدام مجهر مضان.
5. ممثل النتائج
CSP 
HRP - FITC 
اندمج
الشكل 1 : صور الممثل تبين CNS الجنينية في مرحلة 16-17 ، باستخدام أجسام مضادة ضد CSP (الحمراء) ، وHRP (الخضراء). لاحظ تلوين المتميزة للصوار.
CSP 
HRP - FITC
"/>
اندمج
الشكل 2 : صور تبين ممثل PNS الجنينية في مرحلة 16-17 باستخدام أجسام مضادة ضد CSP (الحمراء) ، وHRP (الخضراء). لاحظ تكرار أنماط من الخلايا العصبية الطرفية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الجنين ذبابة الفاكهة هو نظام قوي للتحقيق التغييرات الخلوية والجزيئية أثناء تطوير الخلايا العصبية. في هذا البروتوكول قد أثبتنا كيفية تحضير الأجنة جبل كامل لالمناعية. وقد تكيفت نحن من هذا البروتوكول وصفها في بروتوكول كارول وسكوت ، 1985. ويمكن أيضا هذا البروتوكول يمكن تكييفها لاختبار الأجسام المضادة الخلايا العصبية الأخرى ، ولكن ينبغي أن يتم الاستفادة المثلى من الأجسام المضادة. كذلك ، يمكن للعيوب التنموية للPNS الجنينية والجهاز العصبي المركزي يمكن تصور بسهولة عن طريق مقارنة الأجنة متحولة من خطوط مختلفة. وقد استخدمنا بنجاح هذا البروتوكول لتصور والجهاز العصبي المحيطي الجهاز العصبي المركزي في الأجنة تحمل بروتين المسوخ السيارات. تحت التكبير عالية ونحن أيضا تقييم المسارات محواري داخل الجهاز العصبي المحيطي الجنينية والجهاز العصبي المركزي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
ويؤيد الأمين العام بأموال من جامعة ولاية نيويورك في بوفالو من مؤسسة جون وOishei ر.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 37% formaldehyde | Fisher Scientific | BP531-25 | |
| CSP | Developmental Studies Hybridoma Bank | ||
| HRP-FITC | Jackson ImmunoResearch | 323-095-021 | |
| Alexa Fluor 568 Goat Anti-Mouse IgG | Invitrogen | A-11004 | |
| Vectashield Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 |
References
- Bodmer, R., Barbel, S., Sheperd, S., Jack, J. W., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Transformation of sensory organs by mutations of the cut locus of D. melanogaster. Cell. 51, 293-307 (1987).
- Bodmer, R., Carretto, R., Jan, Y. N. Neurogenesis of the peripheral nervous system in Drosophila embryos: DNA replication patterns and cell lineages. Neuron. 3, 21-32 (1989).
- Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. The Embryonic Development of Drosophila melanogaster. , Springer-Verlag. New York. (1985).
- Carroll, S. B., Scott, M. P. Localization of the fushi tarazu protein during Drosophila embryogenesis. Cell. 43, 47-57 (1985).
- Dambly-Chaudière, C., Ghysen, A., Jan, Y. N., Jan, L. Y. Muscle connections between imaginal discs in Drosophila. Developmental Biology. 113, 288-294 (1986).
