Summary
우리는 개최 준비하는 절차를 설명
Abstract
Drosophila의 배아가의 연결을 발전의 세포 및 분자 기초를 조사하는 매력적인 모델 시스템입니다. 여기의 연결을 단백질에 항체를 사용하여 Drosophila 배아 신경 시스템의 시각화를위한 절차를 설명합니다. 전체 배아 주변 신경 및 중추 신경 시스템이 잘 개별 세포 수준 (..; Bodmer 외, 1987;. Dambly - 쇼디에르 외, 1986 Bodmer 외, 1989)에서 특징 때문에, 이러한 시스템에 어떤 aberrations 수 쉽게 다른 단백질의 연결을하기 위해 항체를 사용하여 식별됩니다. 개발 배아는 배아는 시각화에 대한 적절한 발달 단계에 있는지 확인하기 위해 특정 시간에 수집하고 있습니다. 수집 후, 배 (胚)의 바깥쪽 레이어, chorion 막과 배아를 둘러싼 vitelline 봉투가 고정되기 전에 제거됩니다. 배아는 다음의 연결 항체와 incubated하고 찬란 레이블 차 항체를 사용하여 시각입니다. 단계에서 배아가 12-17 배아 신경 시스템에 액세스할 시각입니다. 12 단계 CNS의 배아 밴드 단축을 시작하고 단계 15 일까지 접합면의 확실한 패턴이 달성되었습니다. 단계 17으로 CNS 계약 및 PNS는 완전히 (캄포스 - 오르테가 외. 1985) 개발되고 있습니다. 따라서 PNS와 CNS의 패턴의 변화는 쉽게 이러한 발달 단계 동안 볼 수 있습니다.
Protocol
1. 시약의 준비
- 100mM 파이프, 2mM EGTA, 1 MM MgSO 4를 사용 PEMFA 버퍼를 준비합니다. 7.0 버퍼의 산도를 조정합니다. PEMFA 버퍼는 필터 소독과 4 ° C.에 저장됩니다
- 중 1ml를 추가하여 PBT를 준비 트리톤 X - 100 100ml 1X PBS (인산이 살린 버퍼) (산도 7.0). 4 스토어 ° C.
- 1X PBS (산도 7.0)에 0.01 % NaAcide와 5% BSA를 (소 혈청 알부민) 준비합니다.
- 0.7 % NaCl 및 0.03 % 탈이온수에서 트리톤 X - 100을 사용하여 생리 식염수를 준비합니다.
- 한 부분은 37 % 포름 알데히드 4 개 부품 PEMFA 버퍼를 결합하여 정착액을 준비합니다.
2. 태아 수집
- 한천 먹이 플레이트와 어댑터를 포함한 플라스틱 병 속에> 100 파리를 배치하여 관심 Drosophila 변형에 케이지를 준비합니다.
- 파리가 케이지에 acclimated하고 그들의 계란을 보유하지 않게, 접시마다 8-12시간을 변경, 72 시간 동안 실온에서 어둠 속에 파리의 새장을 둡니다.
- 실험은 12 시간 동안 배아를 수집하십시오. 컨테이너에서 페트리 접시를 제거하고 교체합니다. 삭제 페트리 접시를 가지고 생리 식염수와 깨끗한 페인트 브러쉬를 사용하여 요리에서 배아를 씻으십시오.
- 훌륭한 체에서 배아를 수집합니다. 초과 누룩을 제거하는 호수와 린스.
- 주걱을 사용하면 부드럽게 배아를 선택하고 모자와 작은 유리관에서 그들을 놓으십시오. 생리 식염수의 1ml에 대해 추가합니다.
3. Chorion 및 Vitelline 점막의 제거 및 고정
- 배아의 수집에 따라 50 % 헵탄 50 %의 정착액 결합하여 헵탄 - 수정 솔루션을 준비합니다. 솔루션은 상단과 하단에 정착액에 헵탄와 계층 것입니다.
- 유리관에 5 분 동안 생리 식염수에서 그들을 잠복기로 배아를 씻으십시오. 파스퇴르 피펫을 사용하여 여분의 호수를 제거합니다.
- 탈이온수와 배아를 씻어.
- 3 분 50 % 표백제에서 그들을 잠복기로 배아를 Dechorionate.
- 탈이온수로 철저하게 배아를 씻어.
- 부드러운 흔들림과 헵탄 - 수정 솔루션 30 분 동안 그들을 잠복기로 배아를 수정.
- 파스퇴르 피펫을 사용하면 메탄올이 튜브에서 헵탄를 떠나있는 정착액 (하단 레이어)를 대체합니다. vitelline 막을 제거하기 위해 적극적으로 흔들어. devitellinized 배아는 튜브의 바닥에 싱크 것입니다.
- 파스퇴르 피펫을 사용하여 새 유리관에서 배아를 수집합니다. 태아에게 메탄올이있는 5 번 린스, 각 시간 5 분 동안 태아를 품어.
4. 항체 스테 이닝, 마운트, 그리고 시각화
- 50% PBT 솔루션과 5 분 50 % 메탄올의 혼합물에서 배아를 Rehydrate. 그렇다면 5 분 백퍼센트 PBT 솔루션 rehydrate.
- 4 1 시간 0.01 % NaAcide 솔루션 ° C.와 함께 5 % BSA에서 그들을 잠복기로 배아를 차단
- 배아 지금 항체 염색법에 대한 준비가되어 있습니다. 0.01 % NaAcide 솔루션 5 % BSA를 사용하여 적절한 농도로 diluting하여 기본 항체를 준비합니다. 우리는 시스테인 문자열 단백질 (CSP), 기공을 갖는 시냅스 단백질과 표면 glycoproteins와 라벨 모든 뉴런에 존재의 연결을 특정 - 탄수화물 잔기를 인식 방지 HRP 또는 말 무 퍼옥시데이즈 항체, 대한 항체를 사용합니다.
- 4 밤새 배아 ° C 기본 항체 솔루션 인치를 품어
- 다음 날, 시간의 과정을 통해 PBT와 배아 10 번 씻으십시오.
- 적절한 농도를 diluting하여 이차 항체 솔루션을 준비합니다. 우리는 1:200의 농도에 알렉사 차 항체를 사용합니다.
- 4 두 시간 동안 태아를 품어 ° C 보조 항체 솔루션 인치
- 시간의 과정을 통해 태아에게 PBT 10 번 씻으십시오.
- Vectashield 장착 매체 하룻밤 배아를 품어.
- 유리 슬라이드에있는 배아를 탑재하고 매니큐어로 커버 슬립을 봉쇄. 형광 현미경을 사용하여 배아를 시각화.
5. 대표 결과
CSP 
HRP - FITC 
병합
그림 1 : CSP (적색)와 HRP (녹색)에 대한 항체를 사용하여 스테이지 16-17에서 배아 CNS를 보여주는 대표 이미지. 접합면의 별개의 얼룩을 확인합니다.
CSP 
HRP - FITC
"/>
병합
그림 2 : CSP (적색)와 HRP (녹색)에 대한 항체를 사용하여 스테이지 16-17에서 배아 PNS를 보여주는 대표 이미지. 주변 뉴런의 반복 패턴을합니다.
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Discussion
Drosophila의 배아가의 연결을 개발하는 동안 세포와 분자 변화를 조사위한 강력한 시스템입니다. 이 프로토콜에서는 immunohistochemistry에 대한 전체 마운트 배아를 준비하는 방법을 증명하고있다. 우리는 캐롤과 스콧, 1985 년 설명된 프로토콜에서이 프로토콜을 적응있다. 이 프로토콜은 다른 항체의 연결을 테스트하는 적응 될 수 있지만, 항체의 최적화 할 수 있습니다. 또한, 배아 PNS와 CNS의 발달 결함 다른 돌연변이 라인에서 배아를 비교하여 쉽게 시각하실 수 있습니다. 우리는 성공적으로 모터 단백질 돌연변이 들고 태아의 PNS와 CNS를 시각화하기 위해이 프로토콜을 사용하고 있습니다. 높은 배율에서 우리는 또한 배아 PNS와 CNS 내에서 axonal 트랙을 평가했습니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
SG는 버팔로의 뉴욕 주립 대학에서와 존 R. Oishei 재단 기금에 의해 지원됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 37% formaldehyde | Fisher Scientific | BP531-25 | |
| CSP | Developmental Studies Hybridoma Bank | ||
| HRP-FITC | Jackson ImmunoResearch | 323-095-021 | |
| Alexa Fluor 568 Goat Anti-Mouse IgG | Invitrogen | A-11004 | |
| Vectashield Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 |
References
- Bodmer, R., Barbel, S., Sheperd, S., Jack, J. W., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Transformation of sensory organs by mutations of the cut locus of D. melanogaster. Cell. 51, 293-307 (1987).
- Bodmer, R., Carretto, R., Jan, Y. N. Neurogenesis of the peripheral nervous system in Drosophila embryos: DNA replication patterns and cell lineages. Neuron. 3, 21-32 (1989).
- Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. The Embryonic Development of Drosophila melanogaster. , Springer-Verlag. New York. (1985).
- Carroll, S. B., Scott, M. P. Localization of the fushi tarazu protein during Drosophila embryogenesis. Cell. 43, 47-57 (1985).
- Dambly-Chaudière, C., Ghysen, A., Jan, Y. N., Jan, L. Y. Muscle connections between imaginal discs in Drosophila. Developmental Biology. 113, 288-294 (1986).
