Primären Zellkulturen aus Drosophila Gastrula Embryonen

Zusammenfassung

Wir bieten Ihnen ein detailliertes Protokoll zur Herstellung von primären Zellen losgelöst von Drosophil A Embryonen. Die Fähigkeit zur Durchführung der effektive RNAi Störung, zusammen mit anderen molekularbiologischen, biochemischen und bildgebenden Verfahren Zelle ermöglicht eine Vielzahl von Fragen, die in adressiert werden Drosophila Primärzellen.

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Herstellung und Kultivierung primärer Zellen losgelöst von Drosophila Gastrula Embryonen. In kurzen, inszeniert eine große Menge von Embryonen von jungen und gesunden Fliegen gesammelt, sterilisiert und dann physisch trennen in einer einzigen Zellsuspension mit einem Glas-Homogenisator. Nachdem er auf Kulturplatten oder Kammer-Objektträgern in angemessener Dichte an Kultur-Medium, können diese Zellen weiter in mehrere morphologisch-verschiedene Zelltypen, die durch ihre spezifischen Zell-Marker identifiziert werden können differenzieren. Darüber hinaus präsentieren wir die Bedingungen für die Behandlung dieser Zellen mit doppelsträngiger (ds) RNA Gen-Knockdown zu entlocken. Effiziente RNAi in Drosophila primären Zellen erfolgt durch einfaches Baden die Zellen in dsRNA-haltigen Kulturmedium erreicht. Die Fähigkeit zur Durchführung von effektiven RNAi Störung, zusammen mit anderen molekularbiologischen, biochemischen, Cell Imaging-Analysen erlauben eine Vielzahl von Fragen, die in Drosophila primären Zellen, insbesondere in Bezug auf differenzierte Muskel-und Nervenzellen beantwortet werden.

Protokoll

1. Vorbereitung fliegen Käfige

1. Wachsen Drosophila (Wildtyp-Stämme wie Oregon-R oder Genotyp) in bequemen Behälter, wie 32-oz Insekten Tassen.
2. Transfer neu eclosed fliegt zu großen Embryo-Sammlung Käfigen oder fliegen Bevölkerung Käfigen.
3. Bewegen Sie den Käfigen in einen Raum mit einer Temperatur von ~ 25 ° C und Luftfeuchtigkeit bis 65% in einer leichten 12-h und einem dunklen 12-h-Zyklus, um die Sammlung von Synchron-Embryonen zu erleichtern.
4. Pflegen Sie die Fliegen in den Käfigen, indem man sie getötet Hefepaste auf Melasse-Platten ausgestrichen. Ändern Sie die Melasse-Platten (mit abgetöteten Hefe paste) einmal täglich für 2-3 d.

2. Sammlung von Synchron-Embryonen

1. Am Tag der Primär-Zelle Vorbereitung, füttern die Fliegen wth frische Platten mit abgetöteten Hefe beschichtet für eine 1-2 h vor-lay Zeitraum einfügen.
2. Kurz vor dem 12-h Dunkel-Zyklus, ersetzen Sie die pre legen Platten mit frischen Melasse-Platten mit einer minimalen Menge von Hefe Paste ausgestrichen. Entsorgen Sie die pre lag Sammlung, die asynchrone älteren Embryonen enthält.
3. Sammeln Embryonen für einen Zeitraum von 1-2 h
4. Entfernen Sie die Platten mit den relativ synchron Bevölkerung von Embryonen und speichern bei 25 ° C für 5-6 h. Embryonen werden in den modernen Gastrulastadium zu diesem Zeitpunkt.

3. Sammlung und Reinigung von Embryonen

1. Lösen Sie die Embryonen von den Platten mit einem nassen Pinsel, und anschließend gründlich mit lauwarmem Leitungswasser durch eine gestapelte Satz Siebe, so dass die Embryonen in die feinsten Sieb sammeln sich am Boden. Spülen Sie für ein paar Minuten, um so viel Hefe und fliegen Trümmer wie möglich zu entfernen.
2. Tipp der Siebe, so dass die Embryonen auf einer Seite sammeln und vorsichtig waschen Sie sie aus dem Sieb in eine dechorionation Korb.
3. Umzug in die Gewebekultur Haube Bereich, ohne dass die Embryonen austrocknen.

4. Homogenisierung von Embryonen und Beschichtung von Zellen

1. Sterilisieren und dechorionate die Embryonen durch Eintauchen in 50% (vol / vol) Bleichmittel für 5-10 min. Spülen Sie den Embryonen von der Wand des Korbes mit 70% (vol / vol) Ethanol. Alternativ, waschen Sie die Bleiche aus Embryonen mit destilliertem Wasser, bevor Ethanol-Behandlung. Von diesem Zeitpunkt an Embryonen unter sterilen Bedingungen und in der Gewebekultur Haube behandelt werden.
2. Spülen Sie den Embryonen gründlich, um das Bleichmittel und / oder Ethanol mit autoklaviertem destilliertem Wasser zu entfernen.
3. Während der dechorionation Schritt füllen Dounce Homogenisator mit dem entsprechenden Volumen von Raumtemperatur M3 mittelfristig auf den Betrag von Embryonen basieren. Das Verhältnis zwischen dem Volumen des Embryos und der Medien sollten nicht mehr als 0,5-ml Embryonen werden: 40-ml-Medien (oder ~ 100-200 Embryonen / ml).
4. Legen Sie die gespülten Embryonen in einem sterilisierten Becher mit der Menge des M3 Medien genug, um tauchen Embryonen. Lassen Sie die Embryonen für 2-5 min einweichen.
5. Demontieren Sie die dechorionation Korb und blot die Nitex Mesh trocken sterilisiert Papierhandtücher.
6. Transfer der Embryonen in den Homogenisator mit einer sterilisierten Pinsel.
7. Homogenisieren vorsichtig mit kurzen Strichen mit einem losen Pistill ohne Erreichen der Boden des Röhrchens, bis alle Embryonen ausgesetzt sind. Dann vorsichtig aber fest, mit acht volle Takte zu homogenisieren. Nicht verdrehen Stößel, wie es oben und unten bewegt.
8. Übertragen Sie die Homogenat in eine sterile 50-ml konische Zentrifugenröhrchen entweder durch Gießen oder Pipettieren, und die Kappe der Röhre.
9. Zentrifuge für 10 min bei 40 g, Raumtemperatur Pellet die Gewebestücke, große Zellklumpen und vitelline Membranen. Übertragen Sie den Überstand mit den Zellen und Eigelb in ein sauberes Röhrchen und wiederholen Sie den Zentrifugationsschritt für 5 min.
10. Vorsichtig den Überstand durch Gießen oder Pipettieren in ein sauberes Röhrchen und drehen für 10 min bei 360g, Raumtemperatur die Zellen zu pelletieren. Überstand verwerfen. Zellpellet in 10 ml Kulturmedium (serum-freiem Medium für RNAi-Experimente).
11. Graf lebensfähigen Zellen mit einer Zählkammer die Zelldichte zu schätzen. In der Zwischenzeit, wiederholen Sie Schritt 4,10 bis Pellet den Zellen.
12. Resuspendieren der Zellen auf eine gewünschte Konzentration. Um zu beginnen, versuchen Sie einen Bereich von 1 ~ 5 x10 ⁶ Zellen / ml und die Platte bei 1,7 bis 2,5 x10 ⁵ Zellen / cm ^2.

5. Primär-Zelle RNAi für Zellen, die auf eine 384-Well-Platte gewachsen

1. Dispense 5 ul dsRNAs in jedes Well in einer Endkonzentration von ~ 250 ng pro Vertiefung einer 384-Well-Platte.
2. Verwenden Sie eine Mehrkanal-Pipette, verzichten 10 ml (1 ~ 4x106 Zellen / ml) von primären Zellen pro Vertiefung in einem serumfreien M3-Medium in einem 384-Well-Platte mit einem anderen dsRNA in jede Vertiefung. Alternativ können die Zellen auf 8-Well-Glas Kammer-Objektträgern für die konfokale Bildgebung kultiviert werden.
3. Centrifuge die Platten für 1 min bei 300g, Raumtemperatur. Kultur der Zellen in serum-freiem Medium bei 25 ° C für 22 h oder bei 18 ° C für 1-2 d.
4. 30 ml Serum-haltigem Kulturmedium in jede Vertiefung.
Centrifuge die Platten für 1 min bei 300g, Raumtemperatur.
5. Legen Sie die Platten in einer feuchten Kammer und Kultur die primären Zellen für weitere 5 ~ 7 d bei 25 ° C.
6. Bild der Zellen entweder live oder nach Immunfluoreszenzfärbung.

6. Repräsentative Ergebnisse:

Bei optimalen Bedingungen werden die Zellen in der Kultur sehen mit einem runden Morphologie gesund. Die Kultur wird wenig Zelltrümmer, und 50 ~ 80% konfluente nach anfänglichen Beschichtung. Diese Zellen werden morphologische Veränderungen, nachdem sie über einen längeren Zeitraum hinweg kultiviert unterziehen. Normalerweise dauert es etwa 5-8 Tage für Zellen in der Kultur vollständig bei 25 ° C unterschieden werden Gute Qualität primären Kulturen sind in der Regel, wie gut die Zellen-of-Interest sind in der Kultur differenziert beurteilt. Zum Beispiel, primäre Muskelzellen haben oft eine Niederlassung Morphologie und werden vielkernigen Myotuben mit Streifen wie Myofibrillen, bestehend aus einer Reihe von Sarkomere. Voll differenzierte Myotuben wird in der Regel spontan in die Kultur zu bewegen. Im Gegensatz dazu bilden differenzierte primären Neuronen Cluster mit ihrem Zellkörper, und verbinden sich mit anderen Clustern mit ihrem Axon-Kabel.

Abbildung 1. Primäre Zellen durchlaufen morphologische Veränderungen, nachdem sie in der Kultur verchromt
(A) A Hellfeldbild von primären Zellen nach rechts, nachdem er in eine Vertiefung einer 384-Well-Platte ausplattiert. Die Mehrzahl der Zellen sind rund und intakt und gut voneinander getrennt. (B) A Hellfeldbild der primären Zellkultur 20 Stunden nach dem Ausplattieren. Primäre Zellen bereits Cluster bilden (große Pfeilspitze) und die Muskeln mit einer Niederlassung Morphologie (langer Pfeil) kann in diesem Stadium erkannt werden. (C) Ein Phasenkontrast-Bild der primären Kultur 5 Tage nach dem Ausplattieren. Die Kultur sieht viel weiter fortgeschritten ist, mit neuronalen Erweiterungen (kleine Pfeile), neuronale Cluster (große Pfeile) und Muskeln (mittlere Pfeil).

Abbildung 2. Beispiele für primäre Zellen mit dsRNAs behandelt in einer 384-Well-Platte kultiviert
Primäre Zellen wurden aus der Embryonen mit Dmef2-Gal4, D42-Gal4, UAS-mito-GFP-Transgene, in denen Dmef2-Gal4 und D42-Gal4-Laufwerk Ausdruck mito-GFP in den Muskeln und motorischen Neuronen bzw. isoliert. Die Zellen wurden mit dsRNAs gezielt entweder lacZ (AC) oder aufgeblasen (wenn) (DF) behandelt. Sowohl primäre Muskeln und Neuronen kann durch GFP (A, C, D, F) zu sehen. Die weißen Pfeile zeigen auf die neuronale Erweiterungen. Phalloidin-Färbung von Aktin (Pfeilspitzen) zeigt eine astähnlichen Muskulatur in der Kultur mit lacZ dsRNAs (B und C) behandelt, sondern Round-up Muskel-Morphologie in die Kultur mit, wenn behandelt dsRNAs (E und F). In der fusionierten Bilder (C, F), sind die Muskeln gelb gefärbt, aber rot negativen zeigt Neuronen und deren Erweiterungen (weiße Pfeile).

Abbildung 3. Konfokale Aufnahmen von primären Muskeln auf die menschliche Vitronektin-beschichteten Deckglas gleitet kultivierten
Primäre Muskeln waren immunofluorescently mit anti-Titin Drosophila (KZ) (rot in der merge) und mit Phalloidin für Aktin (grün in der Zusammenführung) gefärbt. Die Top-Panels sind die Wildtyp-Kontrolle Muskel-und Unterseite diejenigen sind die schläge (CG31374) RNAi Muskel mit verkürzten Sarkomere.

Diskussion

Die Entwicklungsmuster der primären Kulturen von Drosophila-Zellen können sehr unterschiedlich sein, was möglicherweise auf die verschiedenen Variablen während der primären Zelle Herstellungsverfahren. Zunächst fliegt zur Eiablage verwendet werden soll jungen (innerhalb einer Woche alt) und gesund (frei von viralen oder bakteriellen Infektion). Unbefruchtete oder infizierten Embryonen müssen vermieden werden, da sie nutzlos und werden die Zellen aus den Embryonen nicht unterscheiden kann und wird nur für 1-2 Ta...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Schields- und Sang-M3-Medium	Sigma-Aldrich	S3652
Fötales Rinderserum	JRH Biosciences	12103-500M
Insulin aus Rinderpankreas	Sigma-Aldrich	I-6634
Große Embryosammelkäfige	Genesee Scientific	59-101
#25 US-Norm-Sieb	VWR international	57334-454
#45 US-Norm-Sieb	VWR international	57334-462
#120 US-Norm-Sieb	VWR international	57334-474
Dounce-Gewebehomogenisator, Wheaton 7 mL	VWR international	62400-620
Dounce-Gewebehomogenisator, Kontes 40 mL	VWR international	KT885300-0040
Dounce-Gewebehomogenisator, Kontes 40 mL	VWR international	KT885300-0100
Costar, 384-Well-Platte	VWR international	29444-078
Lab-Tek II Kammerobjektträger	Fisher Scientific	171080