Überwachung Immunzellen Trafficking Fluorescent Prion Rods Stunden nach intraperitonealer Infektion

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir eine neuartige Assays für die Überwachung der Prion-Aufnahme und-handel durch Immunzellen sofort nach intraperitonealer Inokulation durch Reinigung und Fluoreszenzmarkierung aggregierte Prion Stangen aus infizierten Gehirn Material dann die Überwachung ihrer Aufnahme und Bewegung an der Injektionsstelle und Charakterisierung der Zellen Vermittlung dieser Ereignisse.

Zusammenfassung

Vorhandensein einer anomalen Form eines Host-kodierten Prion-Protein (PrP), die Protease resistent, pathologische und ansteckend ist charakterisiert Prion-Erkrankungen wie das Chronic Wasting Disease (CWD) der Cerviden und Scrapie bei Schafen. Die Prion-Hypothese behauptet, dass dieses abnorme Konformer die meisten oder alle der infektiösen Prionen darstellt. Die Rolle des Immunsystems in der frühen Ereignisse in peripheren Prion Pathogenese konnte überzeugend für CWD und Scrapie ^1-3 gezeigt. Transgene und pharmakologische Studien an Mäusen zeigten eine wichtige Rolle des Komplementsystems bei der Bindung und Replikation von Prionen früh nach der Infektion ^4-6. In-vitro-und In-vivo-Studien haben auch Prionen Retention durch dendritische Zellen ^7-10 beobachtet, obwohl ihre Rolle in Handel bleibt Unklar ^11-16. Makrophagen sind ebenfalls in der frühen Prion Pathogenese in Verbindung gebracht, aber diese Studien haben sich auf Ereignisse, die Wochen nach der Infektion ^3,11,17 konzentriert. Diese früheren Studien leiden auch unter dem Problem der Unterscheidung zwischen endogenen PrP ^C und infektiöse Prionen. Hier beschreiben wir eine semiquantitative, unvoreingenommene Herangehensweise für die Beurteilung der Prion-Aufnahme und-handel von der Impfstelle von Immunzellen rekrutiert dort. Aggregierte Prion Stäbe wurden aus infizierten Hirnhomogenat durch Waschmittel Solubilisierung von nicht aggregierten Proteinen und Ultrazentrifugation durch ein Saccharose-Kissen gereinigt. Polyacrylamid-Gelelektrophorese, Coomassie Blau-Färbung und Western Blot bestätigt Erholung von hoch angereichertem Prion Stangen in die pelletierten Fraktion. Prion Stangen wurden Fluorochrom-markierte dann intraperitoneal in Mäuse. Zwei Stunden später Immunzellen aus Peritoneallavage Flüssigkeit, Milz und mediastinalen und mesenterialen Lymphknoten wurden für Prion Stabrückhaltesystem und Zell-Untergruppen von multicolor Durchflusszytometrie unter Verwendung von Markern für Monozyten, Neutrophile, dendritische Zellen, Makrophagen und B-und T-Zellen identifiziert untersucht. Dieser Test ermöglicht es zum ersten Mal die direkte Überwachung der Immunzellen Erwerb und Handel mit Prionen in vivo innerhalb von Stunden nach der Infektion. Dieser Assay auch deutlich unterscheidet infektiöse, aggregiert Prionen aus PrPC in der Regel auf dem Host-Zellen exprimiert, die als schwierig und führt zur Interpretation der Daten Probleme in anderen Testsystemen können. Dieses Protokoll kann auch auf andere Impfung Routen (orale, intravenöse, intranervous und subkutanen, zB) und Antigene (konjugierte Beads, bakteriellen, viralen und parasitären Erregern und Proteine, Ei) als auch angepasst werden.

Protokoll

1. Reinigung und Labeling Prion Rods

Dieses Protokoll wird von einem zuvor veröffentlichten ¹⁸ angepasst

1. Homogenisieren 100 Gramm Prion-infizierten Hirngewebe in 900 ml eiskaltem Homogenisierungspuffer (HB, 1X PBS mit 320 mM Saccharose, 150 mM NaCl und 4mm EDTA) 1 min bei maximaler Geschwindigkeit in einer kommerziellen Mixer, dann 2 min auf Eis. Dreimal wiederholen.
2. Centrifuge Homogenat 10 min bei 3000 xg und 4 ° C. Entfernen Sie und speichern Sie auf dem Eis Überstand. Re-suspend Pellet in 1L HB und wiederholen Sie die Schritte 1,1 und 1,2.
3. Pool Überstände und Zentrifuge für 60 min bei 100.000 xg, 0 ° C. Überstand.
4. Re-suspend Pellet in 100 ml 1X Tris-gepufferter Kochsalzlösung (10 mM Tris-HCl, 0,1 mM NaCl und 1 mM EDTA) mit 2% Triton X-100 (TBST). Estimate Proteinkonzentration nach der Bradford-oder ähnliche Tests und stellen bis 5 mg / ml in TBST. Gefühlt auf Eis für 30 min.
5. Zentrifuge für 30 min bei 100.000 xg, 0 ° C. Überstand verwerfen und Pellet waschen mit 50 ml TBST dann 100 mL TBS. Re-suspend Pellet in 100 ml 1X PBS mit 1% Sarcosyl und Protease-Inhibitor-Cocktail und rühren für 120 min bei 37 ° C.
6. Layer-Probe auf 900 ml 320 mM Saccharose und Zentrifuge für 60 min bei 100.000 xg, 10 ° C. Überstand verwerfen und wieder auszusetzen Pellet in 10 mL 2,3 M NaCl, 5% Sarcosyl.
7. Ultraschallbad Probe 5 x 40 Sekunden bei 70% eine Leistung von maximal 1 min Intervallen auf Eis.
8. Aliquot 1 mL Probe in Eppendorf-Röhrchen und zentrifugieren Sie für 15 Minuten bei 13.000 xg, 4 ° C. Wash Pellets zweimal mit TBS und speichern @ -70 ° C oder Konjugat in Schritt 1.9 Fluorochrom.
9. Konjugat 1 Tube gereinigt Prion Stangen mit 1 Fläschchen DyLight 649 Fluorochrom nach dem Protokoll des Herstellers.
10. Börse DyLight Kennzeichnung Puffer für PBS durch Dialyse oder Zentrifugation durch Filter Spalten. Shop in 20 ul Aliquots bei -70 ° C lichtgeschützt bis zur Verwendung.

2. Prion Impfung und die Erholung der Zellen

Dieser Abschnitt umfasst intraperitoneal Prion Impfung und Gewinnung von Zellen aus dem Bauchfell, mediastinalen und mesenterialen Lymphknoten und der Milz.

1. Verdünnen fluoreszierenden Prion Stangen 1:50 in PBS unmittelbar vor dem Gebrauch. Scruff Maus durch die dorsale Nackenfell mit Daumen und Zeigefinger sanft drehen Maus, Sie Gesicht und zurückhalten Schwanz mit kleinen Finger. Supinieren Maus, erhebend Hinterbeine Oberkörper über dem Kopf und hielt ihn leicht auf den Kopf.
2. Mit einer 30G Insulin-Spritze 100 ul von fluoreszierenden Prion Stäbe 1 cm lateral der Mittellinie und 1-2 cm vor dem Iliosakralgelenk. Führen Sie die Nadel 1 cm über die Haut gerichtet 45 ° nach medial. Verwenden 1:50-Verdünnung von fluoreszierenden Kügelchen oder PBS allein als Kontrolle. Inkubieren Mäusen vorgegebenen Zeit vor der Analyse.
3. Euthanize Mäusen nach anerkannten Tier in Pflege und Gebrauch Ausschuss-Protokolle. Injektion von 10 ml PBS in die Bauchhöhle mit einem 12-ml-Spritze und 25G-Nadel. Schütteln Sie Karkasse längs einer Minute. Recover Zellsuspension aus Peritoneum mit der gleichen Spritze und eine 16G Nadel in einem 15 mL konischen Rohr und Zurückhaltung auf Eis, während Karkasse Dissektion weiter.
4. Wet der Bauchseite der Karkasse gründlich mit 70% Ethanol. Heben Sie die Haut an der Mittellinie unterhalb des Brustkorbs mit einer Pinzette und schneiden Sie einen kleinen Schnitt durch die Haut mit einer Schere. Ab dort einen 3-5 cm langen Schnitt durch die Haut aus in beide Richtungen, um Kopf und Schwanz, dann zwei 2-cm Einschnitte von der Mittellinie seitlich von jedem Ende. Peel zurück und Pin die Haut um die Peritonealdialyse und Brusthöhle zu offenbaren. Vorsichtig durch die dünne transluzente Membranen umgeben das Bauchfell geschnitten und spiegeln den Brustkorb auf das Mediastinum zu offenbaren.
5. Suchen und entfernen Sie 2-4 Lymphknoten, leicht dorsal und seitlich neben dem Thymus, medial neben dem Truncus brachiocephalicus, in der Nähe der Bauchseite der Luftröhre. Suchen und entfernen Sie bis zu sechs mesenterialen Lymphknoten, in den weichen, weißen mesenterialen Gewebe eingebettet, die Anker der Darm mit der hinteren Bauchwand. Suchen und entfernen Sie die Milz, eine lange, dunkelrote Orgel befindet sich nur seitlich von der Mittellinie und dorsal in den Darm auf der linken Seite des Bauches. Reserve Lymphknoten in 1 ml RPMI 1640-Medium auf Eis, bis Dissektion ist abgeschlossen.
6. Mazerat und drücken Lymphknoten durch ein 40 um Sieb Sieb in 3 ml RPMI in einer Kunststoff-Petrischale mit dem Stempel einer 1 ml-Spritze. Spülen Sieb mit einer zusätzlichen 2 ml RPMI und übertragen Sie die 5 mL Zellsuspension in ein 15 ml konischen Rohr. Spülen Sie die Petrischale mit einer zusätzlichen 5 ml RPMI und Transfer zum gleichen Rohr. Zentrifuge 5 min bei 250 xg, Überstand verwerfen, resuspendieren Sie das Zellpellet in 1 ml FACS-Puffer (1X PBS, 1% Rinderserumalbumin und 10 mM EDTA) und in ein 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen.

ove_title "> 3. Zellfärbung und Durchflusszytometrie

Das Folgende ist eine typische Färbung Protokoll zur Identifizierung von Immunzellen Teilmengen unter Verwendung von fluoreszierenden Antikörpern gegen gut charakterisierte Immunsystem Zelloberflächenmarker. Alle Antikörper wurden in FACS-Puffer unmittelbar vor der Verwendung verdünnt.

1. Zählen von Zellen und aliquote 10 ⁶ Zellen in Eppendorf-Röhrchen. Centrifuge Zellen (siehe 2.7) und waschen Pellet 2X mit 1 mL FACS-Puffer.
2. Inkubieren Zellen 20 min auf Eis in 100 ul von 2 ng / mL Ratte anti-Maus-CD16/32 endogene Fc-Rezeptoren zu blockieren. Pellet und waschen Sie die Zellen mit FACS-Puffer.
3. Add 100 L 1NG / mL geeigneten fluoreszierenden Antikörpern (y) n zu jeder Probe und Inkubation auf Eis für 1 Stunde. Geben Sie 100 ul FACS Puffer allein zu kontrollieren Zellen. Pellet und waschen Sie die Zellen zweimal mit FACS-Puffer.
4. Re-suspend-Zellen in 1 ml ACK-Puffer (150 mM NH ₄ Cl, 1 mM KHCO ₃ und 0,1 mM EDTA) auf Eis inkubieren für 1 min, um rote Blutkörperchen zu lysieren. Pellet und waschen Sie die Zellen mit FACS-Puffer. Re-suspend-Zellen in 1 ml FACS-Puffer.
5. Sammeln von Daten aus Zellen mit einem Durchflusszytometer der Lage, mehrfarbige Erkennung und Analyse, in der Regel mit 405, 488 und 633 nm Anregung Laser und fünf Minuten vor zehn Fluoreszenzemission Detektoren.

4. Repräsentative Ergebnisse:

Wir reinigten Prion Stangen aus rohen, Prion-infizierten Hirnhomogenat (Abbildung 1) Waschmittel Solubilisierung und Ultrazentrifugation der E2 Elch Hirnhomogenat (Spuren 1 und 2) stark für Prion-Stäbchen (vergleiche Spuren 1 und 3), die auch Protease K angereichert resistent (Bahn 4). Interessanterweise angezeigt unverdaute gereinigt Prion Stäbe eine Glykoform Profil auffallend ähnlich verdaut E2 Hirnhomogenat, was darauf hinweist dramatischen Bereicherung für Prionen. Identisch behandelten normalen Hirnhomogenat produziert keine PK-resistente PrP ^C (Bahnen 5 und 6).

Durchflusszytometrische Analyse von spezifischen Zellpopulationen zeigen, dass Antigen-präsentierende Zellen die Heimat des Bauchfells durch zwei Stunden und behalten fluoreszierende Kügelchen und Prion-Stäbchen, wie dramatisch erhöhte Fluoreszenz über PBS injiziert Kontrollen (Abbildung 2) belegt. Keine Zellen aus dem Peritoneum der PBS-behandelten Kontrollen angezeigt Fluoreszenz über dem Hintergrund (Abb. 2a-g) geerntet, während Zellen von Wulst (Abb. 2H-N) und Prionen (Abb. 2O-U)-inokulierten Mäuse zeigten signifikante Fluoreszenz, vor allem auf Monozyten (Abb. 2I und P), dendritische Zellen (Abb. 2 K und R) und Makrophagen (Abb. 2L und S), und einige Neutrophile (Abb. 2J und Q) und weniger B-Zellen (Abbildung 2T). Bead und Prion-tragenden Monozyten, dendritische Zellen und Makrophagen wurden auch in den Lymphknoten 2 Stunden nach der Impfung (Abb. 2AD und AK, AF und AM und AG und AN,), während nur wenige oder keine PrP ^{CWD-tragenden} Neutrophilen gefunden wurden B-oder T-Zellen gibt (Abb. 2AE und AL, AH und AG und AI und AP bezeichnet) gefunden. Wir erkannten keine Perlen oder Prionen-Stangen in der Milz oder mesenterialen Lymphknoten (Daten nicht gezeigt). In toto zeigen diese Daten, dass Immunzellen Verkehr sehr ähnlich Prionen auf andere partikuläre Antigene.

REAGENT	Fluorochrom	Anregungslasers (nm)	Peakemission (nm)
Prion Stangen	DyLight 649	633	674
1 um Perlen	AlexaFluor 660	633	685
Antibodies
CD11b	eFluor 450	405	450
	Phycoerythrin-Cy7	488	760
CD11c	R-Phycoerythrin	488	575
	Phycoerythrin-Cy7	488	760
Ly6C	Fluoroisothiocyante	488	518
Ly6G	R-Phycoerythrin	488	575
CD21	DyLight 488	488	518
B220	Allophycocyanin-Cy7	633	785
CD3	R-Phycoerythrin	488	575

"> Tabelle 1. Spektrale Eigenschaften von fluoreszierenden Reagenzien

Abbildung 1. Die Reinigung des Prion-Stäbchen aus infizierten Hirnhomogenat. Wir verwendeten eine 10% Rohprotein Hirnhomogenat von einem CWD-infizierter Rehe (E2, Bahnen 1 und 2) als Ausgangsmaterial, aus dem wir aggregierte Prion Stangen (Bahnen 3 und 4) gereinigt. Sowohl roh und gereinigt Materialien zeigte charakteristische Widerstand gegen Protease K-Behandlung (Spuren 1 bis 4), während die normalen Hirnhomogenat nicht (Bahnen 5 und 6). Molekulargewichtsmarker sind in Kd auf der linken Seite des Blots gezeigt. BH, Hirnhomogenat.

Abbildung 2. Durchflusszytometrische Analyse von Immunzellen Menschenhandel Prionen aus dem Bauchfell an Lymphknoten 2 Stunden nach der Impfung. PBS (Platten AG und V-AB), wurden fluoreszierende Kügelchen (HN und AC-AI) oder Prion Stangen (OU und AJ-AP) injiziert in die Bauchhöhle von Mäusen und Zellen aus Peritoneallavage Flüssigkeit (AU) oder mediastinalen Lymphknoten (V-AP) Zwei Stunden später geerntet. Graphen in der ersten Spalte zeigen Zellen von Mäusen mit PBS (Abb. A und V), fluoreszierende Kügelchen (Panel H und AC) und Prion Stäbe (Tafeln A und AJ) behandelt. Fluoreszierende Zellen (rot oder grüne Punkte) und insgesamt Zellen (graue Punkte) aufgetragen, um die relative Größe (forward scatter), Granularität (side scatter) und Anteil der lebenden Zellen, die fluoreszieren zeigen. Eine erhebliche Anzahl von Zellen charakteristisch für Granulozyten erhalten fluoreszierende Kügelchen und Stäbchen. Die Zellen wurden auch mit Antikörpern gegen immune Zelloberflächenmarker und geschlossen für die LYG-Ly6C + Monozyten (Platten B, I, P, W, AD und AK), Ly6c-CD11c-CD11b + Ly6G + Neutrophile (C, J, Q, X, AE gebeizt und AL), Ly6G-Ly6C-CD11b + CD11c + dendritischen Zellen (D, K, R, Y, AF und AM), Ly6G-Ly6C-CD11c-CD11b + Makrophagen (E, L, S, Z, AG und AN), CD3 -B220 + CD21 + B-Zellen (F, M, T, AA, AH und AO) und CD21-B220-CD3 + T-Zellen (G, N, U, AB, AI und AP). Monozyten, dendritische Zellen und Makrophagen erhalten fluoreszierende Kügelchen und Prion-Stäbchen in die Bauchhöhle (Tafeln I und P, K und R und L bzw. S) und transportiert sie zu mediastinalen Lymphknoten (Platten AD und AK, AF und AM und AG und AN bezeichnet), zeigen ähnliche Aufnahme und den Handel mit diesen beiden Teilchen. Neutrophile erhalten eine erhebliche Menge von Kügelchen (J) und weniger Stangen (Q), scheiterte aber an ihnen zu den Lymphknoten zu liefern (AE und AL). B-Zellen erhalten und transportiert einige Stangen (T-und AO), aber praktisch keine Perlen (M und AH). T-Zellen Opfer weder Perlen noch Stangen (N, U, AI und AP).

Diskussion

Hier zeigen wir ein Protokoll für die Kennzeichnung und Nachverfolgung Prionen in vivo, dass erleichtert die Überwachung frühen Ereignisse in peripheren Prion-Infektion. Dieses Protokoll verbessert auf die bisherigen Versuche mit Überwachung Prion-Aufnahme in vitro ⁹ und in vivo ^3,12 von pre-Kennzeichnung hochangereichertes Prion Inokulum eindeutig unterscheiden sie von endogenen PrP ^C. Da infektiöse Prionen und PrP ^C die gleiche primäre Aminosäurese...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
CWD-infiziertes Elchgehirn	Privater Elchhof in Colorado		Verwenden Sie Gehirnmaterial von nicht-menschlichen, mit Prionen infizierten Tieren
Mixer	Oster Professional Products	6694-015	Verwenden Sie einen handelsüblichen Mixer
Zentrifugieren	Sorvall, Thermo Scientific	SS34-Rotor	Verwenden Sie einen beliebigen Zentrifugenrotor, der 3000 x g erreichen und halten kann und ≥ 500-ml-Mengen
Ultrazentrifuge	Beckman Coulter Inc.	50.2 Ti-Rotor	Verwenden Sie einen beliebigen Ultrazentrifugenrotor, der 100.000 × g erreichen und halten kann, und der ≥ 500-ml-Mengen
Bradford-Reagenz	Sigma-Aldrich	B6916
Komplettes Mini-Proteaseinhibitorcocktail	Roche-Gruppe	11 836 170 001
Sonicator	Misonix	MP4000X	Verwenden Sie einen beliebigen Hörner- oder Sonden-Dispergierer, der auf etwa 70 % der maximalen Leistung eingestellt ist
DyLight Antikörper-Markierungs-Kit	Thermo Fisher Scientific, Inc.	53050
Mikrozentrifuge	Eppendorf	55430R	Verwenden Sie eine beliebige gekühlte Mikrozentrifuge, die 13.000x erreichen kann g
Zentrifugal-Filter-Säulen	EMD Millipore	Microcon YM-100	Verwenden Sie einen beliebigen Filter oder eine Dialysemembran mit einer Molekulargewichts-Cutoff von 100 Kd
8–40 Wochen alte FVB-Mäuse	Charles River Laboratories	207	Verwenden Sie beliebige inzüchtige Mausstämme
1 μrote fluoreszierende Kügelchen	Phosphorex	2307	Verwenden Sie beliebige fluoreszierende Kügelchen ≤ 10 μm
RPMI 1640-Medium	Invitrogen	11875-093
40 μm-Zellfilter	Falcon BD	352340
fluoreszierende Antikörper	BD Biosciences	Verschiedene	Verwenden Sie einen fluoreszenten Antikörper, der für Ihre Anwendung geeignet ist.
Durchflusszytometer	Dako	CyanADP	Verwenden Sie einen beliebigen Durchflusszytometer, das zur mehrfarbigen Fluoreszenzerkennung in der Lage ist.