Methodenartikel

Protokoll für die Herstellung eines genetischen Kreuz der Nager Malaria-Erregern

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DOI:

10.3791/2365

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3. Januar 2011

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1National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health, 2School of Life Science, Xiamen University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Genetische Kreuzungen Nagetier Malaria-Parasiten werden durch Zuführen von zwei genetisch verschiedene Parasiten Mücken durchgeführt. Rekombinante Nachkommen sind von der Maus Blut nach Abzug Mücken infizierten Mäuse beißen geklont. Dieses Video zeigt, wie genetische Kreuzungen produzieren Plasmodium yoelii Und ist auch für andere Nager Malaria-Parasiten.

Zusammenfassung

Variation in Reaktion auf Medikamente gegen Malaria und Pathogenität von Malaria-Parasiten ist von biologischen und medizinischen Bedeutung. Linkage Mapping um erfolgreiche Identifizierung von Genen oder loci zugrunde liegenden verschiedenen Eigenschaften in Malaria-Parasiten von Nagetieren 1-3 und 4-6 Menschen geführt. Die Malaria-Parasiten Plasmodium yoelii ist eine von vielen Malaria-Arten von wilden afrikanischen Nagetieren isoliert und wurde angepasst, um im Labor wachsen. Diese Art reproduziert viele der biologischen Eigenschaften des menschlichen Malaria-Parasiten, genetischen Markern wie Mikrosatelliten und amplifizierte Fragment-Längen-Polymorphismus (AFLP)-Marker sind auch für die Parasiten 7-9 entwickelt worden. So können genetische Untersuchungen bei Nagetieren Malaria-Parasiten durchgeführt, um Forschung auf Plasmodium falciparum ergänzen. Hier zeigen wir die Techniken zur Herstellung eines genetischen Kreuz in P. yoelii, die zuerst Pionierarbeit von Dr. wurden. David Walliker, Richard Carter und Kollegen an der University of Edinburgh 10.

Genetische Kreuze in P. yoelii und andere Nager Malaria-Parasiten sind durch Infizieren Mäusen Mus musculus mit einem Inokulum mit gametocytes von zwei genetisch unterschiedliche Klone, die in Phänotypen von Interesse und indem Mücken auf dem infizierten Mäusen 4 Tage nach der Infektion Vorschub unterscheiden durchgeführt. Die Anwesenheit von männlichen und weiblichen gametocytes in der Maus Blut mikroskopisch vor der Fütterung bestätigt. Innerhalb von 48 Stunden nach der Fütterung, im Mitteldarm der Mücke, die haploid gametocytes in männliche und weibliche Keimzellen zu differenzieren, zu befruchten, und bilden eine diploide Zygote (Abb. 1). Bei der Entwicklung einer Zygote in eine ookinete erscheint Meiose bis 11 auftreten. Wenn die Zygote durch gegenseitige Befruchtung zwischen Gameten von zwei genetisch verschiedene Parasiten, genetischen Austausch (. Chromosomale Reassortierung und Cross-overs zwischen den Nicht-Schwesterchromatiden eines Paares von homologen Chromosomen; Abb. 2) abgeleitet sind, können auftreten, die bei der Rekombination von genetischem Material an homologen Loci. Jede Zygote durchläuft zwei aufeinanderfolgende Kernteilungen, was zu vier haploide Kerne. Ein ookinete weiterentwickelt in eine Oozysten. Sobald die Oozysten fällig wird, werden Tausende von Sporozoiten (die Nachkommen des Kreuzes) gebildet und freigesetzt in Mücke hemoceal. Sporozoiten aus den Speicheldrüsen geerntet und in eine neue Maus-Host, wo pre-Erythrozyten und Erythrozyten Entwicklungsphase stattfindet. Erythrozytären Formen sind geklont und klassifiziert in Bezug auf die Charaktere zu unterscheiden elterlichen Linien vor genetische Verknüpfung Mapping. Bekämpfung von Infektionen von einzelnen Eltern Klone sind in der gleichen Weise wie die Herstellung eines genetischen Kreuz durchgeführt.

Protokoll

Aseptische Technik ist für alle Materialien, die in Tieren verabreicht werden, um eine versehentliche Einführung von exogenen Krankheitserregern in Mäusen, die experimentellen Ergebnisse zu verwechseln vermeiden können angewendet werden.

1. Die Infektion von Mäusen mit Blut-Stufen-Malaria-Erregern

  1. Bei Raumtemperatur auftauen zwei Fläschchen mit dem gefrorenen Blut Bühne Malaria-Parasiten zu überqueren. In diesem Beispiel sind zwei Nagetier Malaria-Parasiten Plasmodium-Stämme verwendet yoelii yoelii und Plasmodium yoelii nigeriensis.
  2. Fit eine Spritze mit einer 22-30 Gauge (G) Nadel und erarbeiten 400 ul sterilem, pharmazeutischer Qualität PBS (pH 7,4).
  3. Mit der gleichen Spritze, erarbeiten 100 ul des aufgetauten infiziertes Blut, kehren die Spritze auf und ab, bis der Inhalt homogen vermischt wird. (Optional: eine Pipette verwendet werden, um PBS und infiziertes Blut in ein Sammelrohr vor Transfer in eine Spritze zur Injektion übertragen werden).
  4. Inject 200 ul von Parasiten enthaltenden Lösung direkt in die Bauchhöhle einer Maus. Wenn Sie fertig sind, werfen Sie die Spritze in einem dafür bin. (Siehe auch Ergänzende Materialien für die Wartung von Labor-Mäuse). Im Allgemeinen ist die Standard-Größe des Inokulums zwischen 100-500 ul, je nach der Höhe der Parasitenbefall in der ursprünglichen eingefroren Materialien.
  5. Inject die beiden Parasiten-Stämme in zwei Mäusen gekreuzt werden. Mäuse positiv wird mikroskopisch 3 bis 5 Tage nach den Injektionen. Wenn Parasitämien zwischen 1-5% zu erreichen, mit dem nächsten Schritt fortfahren.

2. Mixed Clone Infektion von Mäusen

  1. Vor gemischt Klon-Infektion, sammeln Schwanz Blut aus den beiden Spender-Mäuse mit den verschiedenen Parasiten-Stämme für die mikroskopische Untersuchung von Giemsa dünne Blutausstriche (Abb. 3) infiziert sind, und für die Messung der roten Blutkörperchen Dichte (siehe ergänzende Materialien für detaillierte Verfahren) .
  2. Berechnen Sie das Volumen einer physiologischen Kochsalzlösung (1,5% w / v Trinatriumcitratdihydrat, 0,85% w / v Natriumchlorid) und Maus Blut benötigt, um ein Inokulum Gemisch zu erzeugen, mit der Parasitämie und der roten Blutkörperchen Dichtemessungen erhaltenen früher.
  3. Passen Sie die Parasiten-Lösung auf eine Endkonzentration von einer Million infizierter roter Blutkörperchen pro 100 &mgr;.
  4. Kombinieren Sie die infiziertes Blut aus den beiden Spendern in einem Verhältnis von 1:1 zu einem Mixed-Klon Inokulum erhalten. Als die beiden elterlichen Klone in der Wachstumsrate unterscheiden, passen die Proportionen eines schneller wachsenden elterlichen einer langsamer wachsenden elterlichen Klon bis 1:2 oder 1:5.
  5. Inject 100 ul der gemischten Probe in das Bauchfell jeder Maus infiziert zu sein. (Siehe auch Schritt 3,9 bis die Anzahl der Mäuse zu bestimmen, die injiziert werden)
  6. Mit dieser Methode infizieren zwei Mäuse jeweils mit dem einzigen elterlichen Stämme. Die Single-Klon Infektionen ermöglicht die Bestimmung der erfolgreichen Übertragung der beiden elterlichen Stämme.

3. Feeding Moskitos

  1. Bereiten Sie drei Käfige mit 300-500 Erwachsenen (männlich und weiblich) Anopheles Mücken stephensi jeden, Alter 5-7 Tage Nachauflauf aus Puppen. Die Behälter sind mit Netzen zu sichern durch eine Kunststoff-oder Metall-Deckel abgedeckt. Zwei Käfige sind für die Fütterung auf die elterliche Klone, die dritte Käfig ist für die Herstellung eines genetischen überqueren.
  2. Ab vier Tage nach dem Mixed-Klon Infektion vorbereiten Giemsa-gefärbten dünnen Blut Schwanz Abstriche von den infizierten Mäusen.
  3. Untersuchen Sie die Flecken unter dem Mikroskop durch das Scannen von mindestens 50 mikroskopischen Feldern in 1000facher Vergrößerung und festzustellen, ob männliche und weibliche gametocytes vorhanden sind.
  4. Männliche und weibliche gametocytes erkennbar sind durch die Anwesenheit von großen Vakuole und große Körner (Abb. 3). Männliche und weibliche gametocytes haben rosa und blau Zytoplasma bzw.. Wenn gametocytes vorhanden sind, fahren Sie mit Schritt 3.6.
  5. Wenn gametocytes abwesend sind, halten die Überwachung täglich bis sie erscheinen. Wenn gametocytes vorhanden sind, weiterhin den folgenden Schritt.
  6. Inject 50 ul Anästhetika Cocktail mit 33 mg / ml Ketamin und 3 mg / ml Xylazin in die Bauchhöhle einer Maus zu jeder infizierten Maus (pro 20 Gramm Maus Körpergewicht) zu betäuben. Finale Dosis Ketamin und Xylazin liegt bei 82,5 und 7,5 mg / kg.
  7. Legen Sie die Maus nach unten auf der Oberseite einen Käfig mit erwachsenen Anopheles stephensi Moskitos, die von Zucker liefern wurden für 24 Stunden ausgehungert und damit die Mücken für 30 Minuten ohne Unterbrechung zu ernähren.
  8. Pflegen Sie die Mücken in einem Insektarium unter Standard-Bedingungen (Temperatur zwischen 24-26 ° C gehalten, siehe auch ergänzende Methoden für die Wartung von Labor-Moskitos).
  9. Verwenden Sie eine infizierte Maus für jeden 50-100 weiblichen Mücken. Euthanize die Mäuse sofort durch Genickbruch nach der Fütterung während die Mäuse noch unter Narkose.

4. Dissecting Mosquito MIDGuts und Counting Oocysten

  1. Neun Tage nach der Fütterung werden die Mücken für die Oozysten in das Insekt Mitteldarm untersucht werden. Die Anwesenheit von Oozysten in den Mücken ernähren sich von Single-Klon infizierten Mäusen, dass gametocytes der beiden elterlichen Stämme zeigt infektiös sind.
  2. Um sezieren eine Mücke Mitteldarm, verwenden Sie einen Aspirator verbunden mit einem kleinen Behälter auf 5 bis 10 infizierten Mücken aus dem Käfig zu sammeln.
  3. Mit CO 2-Gas, betäuben die Mücken und übertragen Sie sie in ein Glas-Petrischale auf Eis. Separate und entsorgen männlichen Mücken. Die Antennen der Männchen sind deutlich buschiger im Vergleich zu den Weibchen.
  4. Füllen Sie zwei Spritzen mit PBS und montieren Sie sie mit 26 Gauge halben Zoll (G ½) Nadeln. Kaution ca. 100 ul PBS aus einer Spritze auf einen Objektträger.
  5. Übertragen von 5 bis 10 anästhesierten weibliche Stechmücken auf den Tropfen PBS und legen Sie die Folie auf einem Binokular.
  6. Mit der gleichen Nadeln, nehmen Sie jede Mücke die Flügel und Beine, dann hält das Insekt an der Brust und hinteren Bauch, ziehen Sie den Körper auseinander, bis die Mitteldarm, ein weißes sackartige Körper freigesetzt wird. Lösen Sie den Mitteldarm und entsorgen Sie den Rest des Körpers.
  7. Fügen Sie weitere PBS auf dem Mitteldarm, wenn die Folien trocken sind. Der Mitteldarm wird entartet, wenn wir getrocknet. Legen Sie ein Deckglas über dem Mitteldärmen.
  8. Untersuchen Sie die Mitteldärmen unter einem Lichtmikroskop bei einer 100-facher Vergrößerung. Zählen Sie die Anzahl von Oozysten in jedem Mitteldarm (Abb. 3). Oozysten sind erkennbar als dickwandige kreisförmige Strukturen, die auf der Außenfläche des Mitteldärmen liegen.
  9. Wenn Sie fertig sind, von Spritzen, Nadeln, und schieben Sie in einem dafür bin entsorgen.
  10. Wenn Oozysten fehlen in der Mitteldärmen sind, Futtermittel Moskitos mit infizierten Mäusen, die mit der höheren Anzahl von gametocytes und geben eine längere Fütterungszeit. Die Temperatur ist entscheidend für diesen Schritt. Vergewissern Sie sich, die Temperatur, bei 24 bis 26 ° C eingestellt

5. Sammeln Sporozoiten von Mücken durch Zentrifugation

  1. Bereiten Sporozoiten Sammelröhrchen wie folgt: Schneiden Sie die Deckel von einem sauberen 0,5-ml-Zentrifugenröhrchen und ein Loch (0.1-0.2 mm Durchmesser) an der Unterseite des Rohres mit einer geflammten 19 G Nadel.
  2. Füllen Sie 1 / 3 des Rohres mit Glaswolle. Legen Sie die Filter-Tube in ein 1,5-ml-Collection-Tube (eine Tube reicht bis zur Ernte Sporozoiten von ~ 100 Mücken)
  3. Am Tag 17 post Fütterung, sammeln Mücken (Schritt 4) aus den Käfigen in einen kleinen Behälter mit einem Staubsauger.
  4. Verwenden CO 2-Gas, um Mücken zu betäuben.
  5. Separate die Weibchen vom Männchen Mücken. Übertragen Sie die betäubten weiblichen Mücken aus dem Behälter zu einem Glas Petrischale auf Eis.
  6. Bereiten Sie zwei Spritzen mit 26 G ½ Nadeln mit PBS gefüllt. Kaution ca. 100 ul PBS aus einer Spritze auf einen Objektträger.
  7. Übertragen Sie die Mücken auf einen Objektträger. Entfernen Sie die Moskitos Kopf, Flügel, Beine, Bauch und unter einem Binokular.
  8. Mit spitzen Pinzette übertragen Brustkörbe in 0,5 ml PBS in einer 1,5-ml-Homogenisator (Mörser und Stößel). Bewahren Sie die Brustkörbe auf Eis (Sporozoiten bleibt infektiös für 2-3 h).
  9. Homogenisieren Brustkörbe auf Eis zu Sporozoiten aus Speicheldrüsen freizugeben (siehe Abbildung 3), und übertragen Sie die Lysate (Homogenate) in das Rohr mit Glaswolle (Schritt 5,1 bis 5,2) mit einer Glaspipette gefüllt.
  10. Zentrifuge für 10 bis 20 sec bei 1000 rpm bei Raumtemperatur.
  11. Sammeln Sie die Flow-Through (die gereinigte Sporozoiten Suspension) mit einer Spritze mit einer 22-30 G Nadel. (Optional: drop 10-50 ul der Flow-Through auf einen Objektträger, legen ein Deckglas und visualisieren die Live-Sporozoiten unter einem Standard-Lichtmikroskop, 400-facher Vergrößerung, siehe auch Abb. 3)
  12. Inject ip 0,1-0,5 ml des Sporozoiten-Suspension in Mäusen (bis zu 200.000 Parasiten können von einer einzigen Stechmücke geerntet werden; siehe Lit. 12). In einem erfolgreichen Fall, wird das Tier infiziert 72 Stunden nach der Injektion.

6. Cloning Progeny mit Begrenzte Dilution

  1. Zweiundsiebzig Stunden nach der Sporozoiten-Injektionen, sammeln Schwanz Blut aus den beiden Spender-Mäuse mit den verschiedenen Parasiten-Stämme für die mikroskopische Untersuchung nach Giemsa-Färbung von dünnen Blutausstrich und für die Messung der roten Blutkörperchen Dichte (siehe ergänzende Materialien für detaillierte Verfahren) infiziert.
  2. Wählen Sie eine Maus Anzeige einer 0,1 bis 1% Parasitämie und deren infizierte rote Blutkörperchen enthalten meist einzelne Parasiten als Spender für die Klonierung. Wiederholen Sie Schritt 6.1 nächsten Tagen, wenn die Mäuse mikroskopisch negativ sind. Wenn die Tiere nicht innerhalb von 14 Tagen infiziert sind, wiederholen Sie Schritt 2 bis 5 und bestimmen Sie die Anwesenheit von Sporozoiten in Schritt 5,11).
  3. Verdünnen Sie die geernteten Schwanz Blut in einem kalten 1:1-Lösung von Kälberserum und Säugetieren Ringer-Lösung (2,7 mM Kaliumchlorid, 1,8 mM Calciumchlorid, 154 mM Natriumchlorid), um so das Ziel, ein conKonzentration von 0,6 bis 1 infizierte rote Blutkörperchen pro 100 ul, und speichern Sie das Inokulum auf Eis. Auf diese Weise sollten die meisten der einzelnen Maus erhalten entweder Eins oder Null Parasiten.
  4. Intravenös injizieren 100 ul verdünnt infiziertes Blut in jeder von 50 bis 100 Mäuse.
  5. Fünf bis sieben Tage später, Bildschirm die Mäuse auf das Vorhandensein von Blut Parasiten durch die Untersuchung Giemsa-gefärbten dünnen Blutausstrich. In einem erfolgreichen Experiment, werden 20-50% der Mäuse infiziert und wird Parasitämie von 0,1-5,0% an Tag 8 nach der Infektion zeigen.

7. Charakterisierung von Progeny Hilfe von genetischen Markern

  1. Sammeln Sie 20 bis 40 ul der Maus Schwanz Blut in einem 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen, dass 0,2 ml gekühlter physiologischer Kochsalzlösung Citrat, kurz vortexen und zentrifugieren für 3 min bei 3000 rpm bei Raumtemperatur zu Pellet die Blutzellen enthält. Auszug DNA sofort oder halten das Pellet bei -80 ° C.
  2. Bereiten Parasiten-DNA mit einem beliebigen Standard-DNA-Extraktionsverfahren. Zur schnellen Isolierung von DNA, verwenden Sie ein High Pure PCR Template Preparation Kit (Roche Applied Bioscience).
  3. Rekombinante Nachkommen sind nach Genotypisierung mit Mikrosatelliten (MS) oder Single-Nukleotid-Polymorphismus (SNP) auf verschiedenen Chromosomen, dass die beiden elterlichen Stämme der genetischen Kreuz unterscheiden kann identifiziert werden. Ein vereinfachtes Verfahren mit einzelnen fluoreszenzmarkierten Primer für MS-Genotypisierung von P. yoelii kann (vgl. Rz 8,9) werden.

8. Kryokonservierung von Blut-Stufen-Malaria-Erregern

  1. Sammeln 0,5-1 ml von infiziertem Blut durch Herzpunktion aus einer narkotisierten Maus mit Parasitämie von 5-20% in 5-10 mL gekühlter physiologischer Kochsalzlösung.
  2. Zentrifuge für 5 min bei 2000 rpm bei Raumtemperatur. Überstand.
  3. Tropfenweise 2x Volumen von Glycerolyte 57-Lösung (Fenwal Laboratories) auf Blut-Pellets und gut mischen.
  4. Die Suspension auf Kryoröhrchen (0,2-0,5 mL pro Röhrchen).
  5. Bewahren Sie die kryokonservierten Blut bei -80 ° C (bis zu 1 Monat) oder in flüssigem Stickstoff.

9. Repräsentative Ergebnisse:

In einem erfolgreichen Experiment, werden 5-10% der geklonten Linien unabhängige rekombinante Nachkommen sein.

Abbildung 1
Abbildung 1. Eine schematische Darstellung des Lebenszyklus und der genetischen Rekombination Ereignisse während eines genetischen überqueren. Genetische Rekombination Veranstaltungen finden während der frühen Phase der Entwicklung in der Mücke. Nach der Befruchtung "haploid" männliche und weibliche Keimzellen von verschiedenen genetischen Hintergründen im Mitteldarm der Mücke sind "diploid" Zygoten gebildet. Die Zygote ist der einzige diploide Stadium des Parasiten Lebenszyklus; Meiose folgt innerhalb von 12 Stunden nach der Befruchtung, und alle nachfolgenden Stufen in der Mücke und Säugetiere bleiben haploid. Die daraus resultierenden Zygoten entwickeln sich zu ookinetes und Oozysten. Wachstum und mitotischen Teilung der einzelnen Oozysten produziert Tausende von Sporozoiten, die in der Moskitos hemoceal freigesetzt werden. Diese Sporozoiten, die Speicheldrüsen wandern sind in der Lage, auf einem Säugetierwirt, wo die Entwicklung der Leber und roten Blutkörperchen Stufen erfolgt übertragen werden. Im Laufe der roten Blutkörperchen Zyklen lassen sich einige Parasiten zu reifen männlichen und weiblichen gametocytes unterscheiden. Der Parasit Lebenszyklus ist beendet, wenn diese gametocytes von einem anderen Mücke, verewigen Übertragung ergriffen werden.

Abbildung 2
Abbildung 2. Vererbung von nuklearen Genen in Malaria-Parasiten und Produktion von rekombinanten Nachkommen. Genetische Rekombination kann durch chromosomale Reassortierung oder Crossover-Ereignisse erzeugt werden. Homozygote Nachkommen durch Selbstbefruchtung zwischen Gameten der gleichen elterlichen Klon 1 oder 2 (A und D), bzw. produziert. B) Heterozygote Nachkommen durch Befruchtung zwischen Gameten der beiden unterschiedlichen elterlichen Klone, rekombinante Kerne (blau Ovale) durch chromosomale Reassortierung allein gebildet produziert. C) Heterozygote Nachkommen aus der gegenseitigen Befruchtung zwischen Gameten der beiden anderen übergeordneten Klone, rekombinante Kernen (rot Ovale) durch Übergänge zwischen den Nicht-Schwesterchromatiden der homologen Chromosomen gebildet produziert.

Abbildung 3
Abbildung 3. Morphologie der Nager Malariaparasiten Plasmodium yoelii. A) Ring Bühne, B) Trophozoiten, C) Schizonten, D) Merozoiten, E) unreifen männlichen gametocyte, F) reifen männlichen gametocyte, G) unreife weibliche gametocyte, H) ausgewachsene weibliche gametocyte, I) Mitteldarm mit Oozysten am Tag 10 post Fütterung (reifen Oozyten durch Pfeile angedeutet; 200-facher Vergrößerung), J) Mücke Speicheldrüsen (100fache Vergrößerung), K) Sporozoiten (400-facher Vergrößerung).

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Diskussion

Wir zeigen die Techniken für die Herstellung eines genetischen Kreuz in das Nagetier Malaria Plasmodium yoelii, die auch für die Produktion von genetischen Kreuzungen in andere Nager malarias. Infektionen von Mäusen mit einzelnen Eltern Klone sind in der Regel durchgeführt, um eine erfolgreiche Übertragung der elterlichen Parasiten zu bestimmen, um sicherzustellen, dass die Eltern kompetent bei der Herstellung von funktionellen Gameten vor der Durchführung eines Kreuzes sind.

Erfolg...

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Offenlegungen

Da die Autoren Regierungsangestellte sind und dies ist eine Regierung zu arbeiten, ist die Arbeit in der Öffentlichkeit in den Vereinigten Staaten. Ungeachtet der sonstigen Vereinbarungen, behält sich das NIH das Recht, die Arbeit zu PubMedCentral bieten für die Anzeige und die Nutzung durch die Öffentlichkeit und PubMedCentral kann Tag oder ändern Sie die Arbeit im Einklang mit ihren Gepflogenheiten. Sie können Rechte außerhalb der USA unterliegen einzurichten, um eine Regierung Nutzungslizenz.

Danksagungen

Wir danken Dr. Randy Elkins, Robin Kastenmayer, Ted Torrey, Dan Pare und Tovi Lehman für die kritische Durchsicht der Manuskripte. Diese Arbeit wurde durch die Interne Research Program der Abteilung für Interne Research, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health, und durch das 973 National Basic Research Program of China, # 2007CB513103 unterstützt. Wir danken NIAID intramural Editor Brenda Rae Marshall für die Unterstützung.

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Materialien

Ergänzende Materialien:

  • Wartung von Labormäusen
  • Wartung von Labor-Moskitos
  • Die mikroskopische Untersuchung von dünnen Blutausstrich mit Giemsa-Färbung
  • Die Messung der roten Blutkörperchen Dichte

Wartung von Labormäusen

Die Weibchen Inzucht Labor Mausstamm BALB / c, im Alter von 5 bis 8 Wochen alt, werden in der Studie verwendet. Mäuse sind in einem Standard mit festem Boden Polycarbonat Käfig mit Draht-bar Deckel, mit Speiser und eine Wasserflasche ausgerüstet untergebracht. Mäuse sind bei einer konstanten Temperatur gehalten (25 ± 1 ° C) auf 12:12 stündigen Licht: Dunkel-Zyklus. Mäuse dürfen auf 2018S Harlan Teklad Globale 19% Protein extrudierten Nagerfutter Feed (sterilisierbar, von Harlan-Teklad) und lieferte mit angesäuertem Trinkwasser ad libitum. Tierversuche sind in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Vorschriften her durch die Animal Care und Verwenden Ausschuss am National Institute of Allergy and Infectious Disease unter Protokoll LMVR11E (National Institutes of Health, Bethesda, Maryland) gesetzt durchgeführt.

Wartung von Labor-Moskitos

Moskitos sind aus einem Labor gezüchtet Kolonie von Anopheles stephensi. Die Erwachsenen sind in Nylon Käfige in einem Temperatur-und Feuchte-kontrollierten Raum (23 bis 25 gehalten ° C gehalten Plasmodium yoelii und Plasmodium chabaudi und 19 bis 21 ° C für Plasmodium berghei; 80 bis 95% Luftfeuchtigkeit; am 00.12 Stunden Licht: Dunkel-Zyklus). Adult Mücken sind mit 10% Glucose und 2,00% para-Aminobenzoesäure (PABA) ergänzt Wasser-Lösung zugeführt. Um qualitativ hochwertige Erwachsene, 500 Larven in einer Low-Density-Zustand in 1 l destilliertem Wasser in einer 1.000-cm 3 offene Schale mit ca. 1 mg Natriumbicarbonat geliefert gewachsen. Nach dem Schlüpfen werden die Larven gegeben TetraMin Pulver (PETCO), bis sie entwickeln sich zu dem Puppenstadium und an die erwachsenen Mücken Käfige für Schwellenländer übertragen.

Die mikroskopische Untersuchung von dünnen Blutausstrich mit Giemsa-Färbung

Mit sauberen Schere abzuschneiden der Spitze (1,0 mm) der infizierten Maus den Schwanz. Geben Sie einen Tropfen (0,5-1,0 mL) der Schwanz Blut auf ein sauberes Objektträger. Maus stoppt Blutungen in 1-2 min. Legen Sie ein sauberes Streuer schieben auf dem Blutstropfen und hält ihn in einem 45 ° Winkel in Bezug auf den Objektträger und lassen das Blut auf die gesamte Breite des Streuers zu adsorbieren. Halten Sie den Objektträger und voranzutreiben den Streuer schieben schnell und reibungslos zu einem dünnen Abstrich zu produzieren. Lassen Sie das Blut Film trocknen, und dann tauchen die Folien in absolutem Methanol. Lassen Sie die Folie an der Luft trocknen noch einmal vor dem Abdecken mit Giemsa (10% Giemsa Farbstoff in destilliertem Wasser). Nach der Inkubation das dünne Blut Filme für 10-15 min bei Raumtemperatur sorgfältig spülen Sie die Dias mit Leitungswasser und lassen Sie sie trocknen. Untersuchen Sie die Anzahl der infizierten roten Blutkörperchen (iRBC; siehe Abbildung 3 für die Morphologie der infizierten Erythrozyten) unter einem Lichtmikroskop mit Immersionsöl bei 1000-facher Vergrößerung (100x mit Objektiv) und berechnen Parasitämie (die Anzahl der iRBC pro 100 RBC gezählt). Verschiedene Stämme von Malariaparasiten variieren in der Wachstumsrate und Pathogenität. Überwachung von Blut Bühne Parasitämien durchgeführt 24h nach Injektionen, abhängig von der Dosis des Blutes Bühne Malaria-Parasiten. Zum Beispiel werden die Mäuse mikroskopisch positive 24 Uhr werden, wenn sie mit 10 7 infiziert RBC intraperitoneal oder 10 6 infizierten RBC intravenös injiziert.

Die Messung der roten Blutkörperchen Dichte

Wie die Ebenen der Parasitämien, roten Blutkörperchen (RBC) Dichte in infizierten Mäusen variiert im Verlauf der Infektion. RBC Dichte sollte innerhalb von 1-2 Stunden vor dem Start des Einzel-und Mixed-Klon-Infektion und das Klonen Experimenten gemessen werden. Es gibt zwei Methoden für die Messung der RBC Dichte: ein manuelles Zählen mit Neubauer-Zählkammer und eine automatische Zählung mit einem Cellometer (Nexcelom Bioscience). Bei beiden Methoden sind je 1 ul der Maus Schwanz Blut mit einer Glaskapillare (VWR) und verdünnen in 10 ml PBS und gut mischen. Für die Verwendung einer Neubauer-Zählkammer, Last 20 ul der Suspension auf die Hämazytometer. Legen Sie die Hämazytometer auf einem Lichtmikroskop mit 10x Objektiv. Die Hämazytometer enthält ein Raster in 9 große Quadrate und 4 große Quadrate an den Ecken gegliedert werden weiter in 16 kleine Quadrate unterteilt. Zählen Sie die Gesamtzahl der Zellen in jeder der 16 kleine Quadrate in den vier Eck-Quadraten. Um zu vermeiden, Zählen Bias oder Zählen von Zellen, die ein Raster Linie überschneiden, gehören eine Zelle als "in", ob er sich der rechten oder oberen Linien und "out", ob er sich unten oder links Linien. Schätzen Sie die Anzahl der Zellen pro ein kleines Quadrat und dividieren durch 0,00625 (das Volumen eines kleinen Platz beträgt 6,25 nL). Daraus ergibt sich die Anzahl der Zellen pro Mikroliter (μ L). Aus diesen Daten berechnet den endgültigen roten Blutkörperchen Dichte durch Multiplikation mit 10.000 (ein Verdünnungsfaktor). Spülen Sie das Deckglas und Zählkammer mit destilliertem Wasser und 70% Ethanol, an der Luft trocknen. Alternativ laden 20 ul der Suspension auf einen Cellometer Zählkammer gleiten. Legen Sie die Folie in einen Cellometer schieben Kammer (dem Leser). Starten Sie den Cellometer Software, wählen Sie den "roten Blutkörperchen"-Option, und geben Sie einen Verdünnungsfaktor von 10.000. Notieren Sie sich die RBC Dichte.

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